1、 基于 1H NMR 代谢组学的阳明经穴特异性研究作者：吴巧凤，徐世珍，余曙光，颜贤忠，唐勇，刘娟，毛森，周思远，梁繁荣【摘要】 目的采用基于核磁共振 (1H nuclear magnetic resonance，1H NMR)和模式识别技术的代谢组学方法分别观察针刺阳明经穴与他经穴位对健康男性尿液代谢产物的影响，从针刺对机体代谢流影响的角度探讨阳明经穴的特异性。方法 60 例健康青年男性随机分为足三里组，梁门组，巨髎组，阳陵泉组，委中组和空白对照组，每组 10 例。分别针刺相应穴位，连续针刺 5 d，获取受试者晨尿，采用 1H NMR 检测尿液代谢物，运用主成分分析和正交偏最小二乘判别分析等
2、模式识别方法分析所得数据。结果针刺阳明经穴对机体尿液代谢物的影响基本一致，均可以升高尿液中马尿酸和氧化三甲胺的含量，降低甘氨酸含量;针刺阳明经穴与针刺阳陵泉对尿液代谢物的影响差别不大，但与针刺委中后的差别明显;针刺委中后尿液代谢物中肌酐明显升高。结论对尿液代谢物的模式识别分析显示，阳明经穴具有一定的共性，但与阳陵泉的差别不明显，与委中的差别较为明显，有关原因尚需进一步深入研究。 【关键词】 针灸;经穴特异性;阳明经;代谢组学经穴特异性理论是阐明经穴功能和指导针灸临床治疗的重要基础，也是发展经络理论、评价针灸疗效的重大选题1，2 。本研究从整体代谢流的角度，采用目前系统生物学中以观察复杂系统终端
3、产物为代表的代谢组学检测技术和数据分析方法，对针刺阳明经和他经穴位后机体尿液代谢物进行分析，从针刺对机体代谢流影响的角度探讨阳明经的特异性，为经穴特异性研究提供新的生物信息学依据，为代谢组学相关技术和数据分析方法在经穴特异性这一新领域的应用提供借鉴。1 研究对象受试者均为男性健康志愿者，汉族，年龄 2025 岁，体质量指数 1824。经检查受试者无糖尿病、柯兴氏综合征、甲状腺功能低下、性腺功能低下等代谢功能异常，无心脑血管疾病，无肝、肾功能不全或重要器官功能障碍，无精神疾患，无吸烟、嗜酒等不良嗜好。共收集 60 例受试者，随机分为 6 个组，分别为足三里组，梁门组，巨髎组，阳陵泉组，委中组，和
4、空白对照组，每组 10 例。2 方法2.1 穴位治疗试验前所有受试者接受标准化饮食 1 周，忌辛辣刺激饮食，避免剧烈运动。受试者每日固定时间接受针刺治疗，分别针刺相应的穴位并得气后，在相应穴位附近旁开 0.5 cm 处再浅刺一针，不得气，作为辅助电极，连接 G6805II 电针仪，采用疏密波，频率为 16 次/min，电压 220 V，逐渐加大电流至能耐受为度(有明显的震颤感，但又不过分强烈) 。1 次/d，30 min/次，连续针刺 5 d。空白对照组不给予任何针刺刺激。针刺全部结束后第 2 天收集受试者晨尿，10 000 r/min 离心 10 min，获取尿液上清样本。2.21H NMR
5、 数据采集和分析取 350 l 的尿液，分别加入 30 l的 TSP/D2O(1 mg/ml)，350 l 磷酸缓冲溶液，充分振荡混匀后，13 000 r/min 离心 10 min。取 600 l 上清加入 5 mm 核磁共振管中混匀，待用。样本分别进行 1H-NMR 实验。采用有预饱和的 1D NOESY 脉冲序列，取如下参数：谱宽 8 000 Hz，混合时间 0.15 s，驰豫延迟时间 2 s，采样点数 32 k，累加次数 64 次;在驰豫延迟和混合期间采用预饱和方式抑制水峰，谱仪偏置设置在水峰的位置。FID 信号经过填零为 64 k 点之后，再加上 0.5 Hz 的线增宽因子，经傅立叶
6、变换转换为 NMR 图谱。以 TSP 为化学位移参考峰的位置，并定为 0。对所得 NMR 数据经傅立叶变换得到谱图，经相位校正和基线校正之后，对一定区间内的谱图按每段 0.04 ppm 的宽度进行分段积分，同时排除包含溶剂峰和尿素峰的部分( 4.66.2) 。其中 NOESY 数据积分范围为 0.4 9.4。将积分按每张谱的总积分强度归一化。所得数据输出并转换到 Excel 文件保存。2.3 模式识别分析将保存的 Excel 格式数据输入到 SIMCA-P+软件(v10.04，Umetrics，Ume ，Sweden) 进行模式识别分析。数据采用 Pareto 标度化(Pareto scali
7、ng)进行预处理之后; 再采用正交信号校正(OSC，orthogonal signal correction)滤噪，然后再进行 PCA 和 PLS-DA 分析。分析结果以得分图 (scores plot)和载荷图 (loadings plot)的形式表示。3 结果3.1 针刺阳明经穴对机体尿液代谢的影响分别针刺足三里，梁门和巨髎后机体尿液代谢物的改变如图 1a 所示。结果显示 3 个组在得分图上均分布于 PC1 的 2SD 范围内，即各组经模式识别后分离趋势不明显。表明针刺这 3 个穴位对机体的尿液代谢影响效果较为一致。但与空白对照组相比，针刺阳明经穴后尿液代谢物明显不同(图1b)，模式识别后
8、与空白对照组分布于不同区域，阳明经穴各组主要分布于得分图的 PC2 正方向，而空白对照组主要分布于 PC2 负方向。对应的因子载荷图(图 1c)显示，针刺阳明经穴可以明显升高尿液中肌酐( 3.06,4.06)，马尿酸 ( 7.82，4.06)和羟基丁酸 ( 3.98)的含量，降低甘氨酸( 3.58)的含量。足三里组 ()、梁丘组()、巨髎组()与空白对照组() 图 1 针刺阳明经穴位后血浆代谢物模式识别结果3.2 针刺阳明经穴与针刺阳陵泉对机体尿液代谢的影响针刺阳明经穴与针刺阳陵泉穴后机体尿液代谢物经模式识别分析后显示，各组有差别，但差别不明显，表现为在得分图上聚类分布的趋势较不明显，提示针刺
9、阳明经穴与针刺阳陵泉对机体尿液代谢的影响似乎差别不大。足三里组 ()、梁丘组()、巨髎组 ()与阳陵泉组()图 2 针刺阳明经穴位与阳陵泉后尿液代谢物的比较结果3.3 针刺阳明经穴与针刺委中对机体尿液代谢的影响比较针刺阳明经穴与针刺委中之后机体尿液代谢改变的异同可以看出，针刺委中组在得分图上主要分布于左上方，成聚类分布的趋势，与阳明经各组分布范围明显不同(图 3a)。对应的因子载荷图( 图 3b)显示，造成委中组与其它各组差别的主要物质是肌酐(3.06，4.06)明显升高，而针刺阳明经穴主要表现在尿液中马尿酸( 7.82，4.06)和氧化三甲胺( 3.26、 7.54) 的升高。4 讨论经穴特
10、异性理论一直是针灸研究中的热点问题1，2 。多年来，研究者采用传统研究手段与 X 射线荧光分析(Protonbeam Induced X -Raye Mission，PIXE)、激光多普勒、红外辐射检测等多种现代技术相结合的方法对经穴特异性进行了评价和研究，在经穴形态结构3、生物物理特性4 、经穴效应特异性57、经穴( 经脉)一脏腑相关理论等方面作了大量的临床与基础研究，取得了一系列的研究成果。我们认为，经穴特异性是一种相对特异性，具有生物物理特异性，时间动态特异性，空间特异性，脏腑相关特异性等多种表现形式，但最终的体现和结局应该是经穴效应的特异性8,9。另一方面，机体作为一个复杂的整体系统，
11、外界刺激的扰动会干扰内源性生化物质的浓度、比例、结合或流量。针灸刺激对机体的作用具有良性、整体和综合调整的特点，是能量、物质和信息流动的综合体现，针灸刺激影响整个机体的有效功能很可能通过代谢物反映出来，通过对代谢物的检测和分析，采用数学、物理学、信息学等多种研究方法，深入挖掘所得数据的规律性，从复杂的数据中最大限度地提取信息，很可能深入认识针灸刺激对机体内部物质和信息的扰动过程以及机体对针灸刺激的应答模式10。代谢组学是继基因组学、蛋白质组学等之后发展起来的又一组学技术，它通过生物体液和组织来对完整的生物体(而不是单个细胞) 中随时间改变的代谢物进行定量分析;能够全面研究机体新陈代谢活动链上的
12、终产物的变化，然后将这些多维代谢轨迹与病理生理过程中的生物学事件联系起来，反映生物体系的状态1113，这与传统中医有异曲同工之处14,15 。用代谢组学方法来研究中医理论和中医药，有可能成为中国传统医学走向国际化的通用语言16。近年来代谢组学技术在中医学研究中的作用越来越受到重视，并分别在中药的作用机制与毒理、疗效与安全性评价、质量控制，中医证候的本质等方面进行了大胆的尝试。针灸学作为中医药理论的一部分，采用代谢组学研究针灸基本理论和作用规律，有望为针灸的治疗效应提供更新、更符合机体实际情况的证据，为针灸基础研究提供新的思路和方法。模式识别是把具体事物进行正确归类的科学，其内涵可以概括为信息处
13、理、分析与决策，它可以对 1H NMR 所得的代谢物数据进行分类识别，并结合其对应的因子载荷图(loading plots)和代谢谱峰寻找关键代谢物或生物标志物，通过挖掘这些关键代谢物或小分子生物标志物的代谢意义，就能明确外界刺激对机体影响的“代谢组学特征”和生物意义。有研究表明，由于在 NMR 数据分析中结合应用了模式识别，使得代谢组学的的研究结果比基因芯片、蛋白芯片等得到的结果更为精确(代谢组学达到了 96%以上的精确度)17。足三里组 ()、梁丘组()、巨髎组()与委中组() 图 3 针刺阳明经穴位与委中后尿液代谢物的比较结果本研究发现，尽管针刺不同穴位后血浆代谢物各不相同，但通过模式识
14、别分析不难发现，针刺“足三里” ，“梁门”，“ 巨髎” 后血浆代谢物呈簇类分布或有共同变化的趋势，说明针刺这三个穴位对机体尿液代谢的干扰基本相似，这与血液研究的结果类似。但是，针刺“阳陵泉” 后机体尿液代谢与针刺阳明经穴相比变化不明显，这与血液研究的结果显著不同，我们在前期血液研究中发现，针刺“阳陵泉 ”后与针刺阳明经穴机体血浆代谢物明显不同，模式识别后能显著分开，为阳明经与阳陵泉的区别提供了证据，但本次对尿液的研究却显示针刺阳明经穴与针刺阳陵泉之间的区别并不显著，其具体机制和原因有待深入研究。与血液研究结果类似的是，模式识别能明显将委中组与阳明经穴组分开，即可以初步判断委中不属于阳明经。从具
15、体代谢物来看，针刺委中后尿液代谢物中肌酐明显升高，而针刺阳明经穴主要表现在尿液中马尿酸和氧化三甲胺的升高。肌酐为人体肌酸代谢的终产物，后者为人体的生理活动提供能量，正常情况下，肌酐的含量变化与人体的运动密切相关。委中是治疗腰背痛、下肢痛等的主要穴位，与人体运动系统的功能密切相关，这是否提示针刺委中能够提高机体对能量的利用度?或者增加机体对能量物质的摄取? 马尿酸是人和肠道菌群共同的代谢物，单纯人体的胃肠道细胞代谢不会形成马尿酸，本研究的结果提示针刺阳明经穴可能通过调节胃肠道中肠道菌群的数量或者功能发挥改善胃肠道功能的作用。但针刺这些不同的穴位是通过何种途径调节这些尿液代谢物的，其进一步的生理意义是什么，这些问题都亟待进一步研究。本研究提示，基于 NMR 和模式识别的代谢组学技术为从代谢角度研究阳明经穴特异性提供了新的生物信息学线索，部分研究结果对中医理论和中医临床实践具有一定的参考价值。但值得注意的是，由于代谢组学是一门以研究代谢终产物为目标的技术，各种不同代谢物的结果可能存在一定分歧，例如血液、尿液代谢物的结果很可能有所不同，这就要求研究者动态、全方位地把握代谢物受针灸刺激的最终结果，提取有用信息进行深入分析。此外，代谢组学所获得的信息是海量的，如何抓住关键的生物标记物，从代谢组学角度深入揭示针灸作用的特点和规律值得进一步研究。【
