1、 基于包被包膜糖蛋白抗体纳米金磁性微粒的无试剂安培免疫传感器作者：干宁 王鲁雁 李天华 郑 磊 王 峰【摘要】 在玻碳电极(GCE) 表面固定对 H2O2 有催化还原活性的富马酸二甲酯联吡啶铜(GCE|CuL);再在 GCE|CuL 表面修饰一层金磁微粒壳聚糖复合膜(nano Au/Fe3O4/Chit), 进而固定艾滋病毒(HIV)诊断标志物包膜糖蛋白(gp160)抗体(anti gp160), 由此构建了一类快速检测 gp160 的无试剂安培免疫传感器。当该传感器在含gp160 溶液中 37 下温育 30 min 后, 传感器表面生成的免疫复合物随 gp160 浓度的增大而增加, 导致 C
2、uL 对 H2O2 电催化还原效果降低, 催化电流呈现下降趋势。在 PBS 溶液(pH 7.0)和-300 mV 下, 催化电流的降低值 Io 与 gp160 浓度在 1400 g/L 呈线性关系; 检出限为 0.5 g/L(3)。研制的免疫传感器检测 gp160 时, 一步免疫反应即可得结果, 较相同条件下包被 gp160 抗体的纳米金单分子层修饰电极灵敏度更高, 检测范围更宽, 有望用于艾滋病人血清标志物gp160 快速筛测。 【关键词】 富马酸二甲酯联吡啶铜, 纳米金, 磁性微粒, 壳聚糖, 艾滋病毒，包膜糖蛋白, 安培免疫传感器1 引 言人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的早期检出对杜绝艾
3、滋病传播极其重要, 常用的艾滋病诊断方式是抗体检测1 。在艾滋病毒感染早期, 人体内尚未出现抗体(即 “窗口期”), 已具有很强的传染性2 。此时，“窗口期 ”HIV 的诊断标志物包膜糖蛋白抗原(gp160)已经存在于人血清中, 但含量很低 (8 g/L), 若能对其检测将有效缩短诊断“窗口期 ”3。目前, 主要采用化学发光酶联免疫(ELISA)法检测痕量 gp1603, 该法虽然结果准确, 但是操作繁琐、仪器昂贵, 限制了其推广。电化学免疫分析具有操作简便、样品量少、快速灵敏等特点, 已应用于临床检测49。由于缺乏简单而又能长期保持抗体生物活性的电极固定方法, 且通常需要在反应体系中加入电子
4、媒介体(eT)以加速电子传递, 导致基底干扰并使抗体失活, 限制了其应用5 9。近年来 , 通过在金胶等具有良好生物兼容性的纳米颗粒上包被抗体, 并将其与 eT 共固定到电极表面, 获得了灵敏度高、无需外加 eT、且抗体不易失活的无试剂安培免疫传感器10 14。He 等9通过在电极表面的壳聚糖(Chit) 膜上层层电沉积纳米金 , 包被癌胚抗原(CEA)抗体 , 获得了测定 CEA 的安培免疫传感器。由于电极表面有多层纳米金, 比单分子层纳米金吸附更多抗体, 因此在检测 CEA时线性范围更宽, 灵敏度更高。然而该电极检测需在电解池中加铁氰化钾作 eT, 体系复杂，易导致抗体失活, 且电极表面需
5、多步纳米修饰, 操作繁琐。本研究组在单分散 Fe3O4 微粒表面负载纳米金, 合成了 nano Au/Fe3O4 金磁性微粒12。在每个 Fe3O4 微粒表面包裹着多个纳米金, 再接枝到电极表面形成单分子层将比单层纳米金吸附更多抗体, 扩展传感器检测范围, 提高灵敏度。某些铜配合物具有催化 H2O2 活性, 可代替 H2O2 酶被修饰在电极表面制作 H2O2 传感器15 。基于以上思路, 本实验合成了对 H2O2 具有催化活性的富马酸二甲酯联吡啶铜(CuL)16, 将其与 gp160 抗体包被金磁微粒壳聚糖复合膜共固定在 GCE 上, 制备了 gp160 免疫传感电极, 并用于血清样本检验。2
6、 实验部分2.1 仪器与试剂CHI660B 电化学分析工作站(上海辰华公司);三电极体系：GCE|CuL/nano Au/Fe3O4/Chit/anti gp160(=2 mm)为工作电极, 铂电极为对电极, 饱和甘汞电极为参比电极;Easysizer20 激光粒度仪(美国欧美克公司);VF320 型 X 射线荧光光谱仪 (日本岛津公司);PHI5400X 射线光电子能谱仪( 美国 PE 公司), Hitachi X650 扫描电镜(日本 Hitachi 公司)。直径 50400 nm 的 Fe3O4 微粒(美国 Fluka 公司);3巯丙基三乙氧基硅烷(95%)、壳聚糖(Chit, 脱乙酰度
7、90.0%)及AuCl3HCl4H2O 购自上海国药试剂公司。人抗人类免疫缺陷病毒抗体(HIV)ELISA 试剂盒(美国 ADL 公司)：包括不同浓度(0 500 g/L)的 gp160 抗原和单克隆 gp160 抗体(Anti gp160);牛血清蛋白(BSA, 96%99%)与人血清蛋白(HSA, 96%99%)购自美国 Sigma公司。其它试剂均为分析纯, 实验用水为超纯水(美国 Millipore 纯水器)。2.2 Nano Au/Fe3O4/Chit 共聚物合成按文献16合成富马酸二甲酯联吡啶铜(Cu(bpy)2(H2O)2(C6H8O4)2(ClO4)4)。Nano Au/Fe3O
8、4 溶胶 3.4 实验条件的优化优化了 CuL 和抗体在 GCE 电极表面的修饰条件。GCE 在 1 mmol/L CuL 中浸泡后, 电流在 010 h 内不断增加, 10 h 后不再增加, 说明此时 CuL 在电极表面吸附基本饱和。将得到的 GCE|CuL 表面固定 nano Au/Fe3O4/Chit 膜, 并于 25 在 100 g/L gp160 抗体(试剂盒中贮备液浓度)溶液中浸泡, 07 h 内电流不断下降 , 7 h 后基本稳定, 说明抗体在金胶上吸附饱和。因此 CuL 和 gp160 抗体的浸泡时间分别选择 10 和 7 h。图 6 免疫传感器对 gp160 检测原理示意图F
9、ig.6 Procedure of immunosensor for gp160 detection 免疫反应受 pH、H2O2、浓度、温育时间等影响。考察了免疫传感器在不同pH 底液中对 1.0 mmol/L H2O2 的催化响应。研究发现, 峰电流在 pH 3.57.0 逐渐增大;pH7.0 后, 峰电流开始减小。因此,最佳 pH 值选择 7.0。本传感器对 H2O2 响应迅速, 电流达到稳态仅需 2 s, 明显快于纳米金修饰电极10。H2O2 浓度在 0.11.0 mmol/L 范围内与电流响应呈良好线性关系;浓度再提高, 电流响应改变不大。所以, 本实验采用 1.0 mmol/L H2
10、O2。随着温育时间的延长, 催化电流的下降值 i0 随之增加 , 当达到 30 min 后趋于稳定值, 说明此时电极表面免疫反应已经进行完全。这比一般的酶联免疫温育时间(5060 min)缩短了 2 倍13, 这是因为本方法基于一次性免疫分析 , 较夹心ELISA 法减少了二抗的加入。考察了电位对 H2O2 安培测定的影响, 当电位在-150 mV 附近时, 就可以观察到 H2O2 在电极表面的还原, 电位负移到-400 mV, 电流大幅度增大。这是因为电位越负 , 对H2O2 还原驱动力就越大。当电位为 -300 mV 时, 安培响应达到一个平台。所以本传感器的最佳反应条件为： 在 pH 7
11、.0 的 PBS 底液中, 1.0 mmol/L H2O2, 在 37 (试剂盒标示反应温度)下温育 30 min, 电解电位为-300 mV。3.5 Fe3O4 磁性粒子尺寸与磁性对金胶及抗体的吸附影响考察了粒径为 50, 100, 200, 300 和 400 nm 的 Fe3O4 微粒在相同条件下吸附纳米 Au 的情况。TEM 研究发现, Fe3O4 微粒粒径越大, 负载的纳米 Au 越多, 且吸附的抗体也越多; 但是如果金磁微粒粒径过大, 电极表面 Chit 膜固定后, 循环伏安扫描 50100 次后容易脱附, 造成电流响应急剧下降。比较发现 Fe3O4 微粒粒径为 200 nm 时合
12、成的金磁微粒在电极表面扫描后不容易脱附, 且可负载 1020 个直径约为 30 nm 纳米 Au。Crumbliss 等18研究发现, 小尺寸的金胶(30 nm)能给予蛋白质更多的取向自由度, 从而增加辅基靠近金胶的机会, 使电子方便地通过金胶的传输通道。而本实验合成的单分散 nano Au/Fe3O4 上金胶直径约为 30 nm, 故具有较好的抗体包被和电子传输能力。由于 Fe3O4 具有超顺磁作用, 彼此容易发生团聚而使得电极上的纳米界面丧失, 且随着尺寸变小团聚速度加快17, 本实验中, 50100 nm 金磁微粒在 Chit 膜中 30 min 内会发生团聚, 引起电流响应变小;而对于
13、粒径200 nm 的金磁微粒,团聚效果较小, 在 Chit 中分散 7 d 后也很少团聚 , 且制备的传感器电流大小不变。因此选用 200 nm 粒径的单分散 Fe3O4 微粒负载纳米金并包被抗体。3.6 多种免疫传感器对 HIVgp160 的安培测定比较在优化条件下, 传感器温育后安培响应的降低百分率与 gp160浓度呈良好的线性关系, 线性范围为 1400 g/L, r=0.9960, 检出限为 0.5 g/L(3), 与化学发光 ELISA 法相当(0.2 g/L, 0.5350 g/L)3, 明显优于酶联免疫吸附比色法(2 g/L, 5150 g/L)2。但是本法较上述方法简便快速、价
14、廉。分别比较了本电极(GCE|CuL/nano Au/Fe3O4/Chit/anti gp160)和抗体包被的纳米金修饰电极(GCE|CuL/nano Au/Chit/anti gp160), 以及抗体包被 chit 膜电极(GCE|CuL/Chit/anti gp160)对不同浓度 gp160 的检测效果。结果表明, 在相同制备条件下, 本电极对 gp160 检测灵敏度(2.5 AL/gcm2)最高, 金纳米修饰电极和 chit 膜电极分别为 0.7 和 0.2 AL/gcm2), 测定范围也较后二者(1250 g/L 和 2100 g/L)宽近 12 倍。这是因为每个金磁微粒上有多个纳米金
15、, 其在电极表面形成单分子层时比纳米 Au 有更多的 gp160 抗体固定点, 所以本研究传感器灵敏度更高, 检测范围更宽。将本电极在 4 储存于 pH 7.0 的 PBS 溶液中 45 d 后, 其对50 g/L gp160 安培响应降低 6.5%, 说明该传感器具有较好的稳定性。3.7 干扰实验、耐用性和电极表面再生以 50 g/L gp160 为比对标准, 依次加入 8.8 mmol/L 葡萄糖, 0.24 mmol/L 尿酸, 0.5 mmol/L 抗坏血酸(人血清中主要组分的正常浓度水平), 研究表明响应电流变化很小 (10%), 证明该传感器具有良好的抗干扰性。采用同一电极测定 5
16、0 g/L gp160 30 次后电流下降值7%。继续测定会使少量血清蛋白吸附在电极表面, 导致电流减小, 但随后将电极在含有 0.1 mol/L 的盐酸胍PBS 底液中浸泡 12 h, 抗原从抗体上脱附, 其电流即可恢复到未使用前状态。因此可用盐酸胍PBS 浸泡使电极表面再生。3.8 加标回收实验在正常人血清中加入了 610 g/L gp160 标准品, 取 1 mL 样本溶解在 5 mL 电解质中, 采用本方法进行测定，并与标准 EILSA法对比, 结果见表 1, 吻合性较好。本方法的加标回收率为95% 102%, 表明本传感器适用于血清中 HIV gp160 含量的测定。表 1 血清样品中 HIV gp160 检测结果(n=7)【
