1、磷酸化多肽兔源多抗制备免疫原：磷酸化多肽与 KLH 蛋白的连接，采用-SH 法或NH2 法。动物：雄性新西兰家兔（2 只/抗原）助剂：福氏完全助剂（CFA,Sigma）福氏不完全助剂（IFA,Sigma ）乳化：免疫原溶液与助剂 1：1（体积）高速搅拌充分乳化。免疫剂量：200g/兔/次。免疫容积：1ml/兔/次。免疫部位：背部皮下，多部位/次。方案：d0 第一次免疫注射，采用 CFA,免疫前耳缘静脉采血 12ml，提取血清作为将来实验的阴性对照。d14 第二次免疫注射,采用 IFA。d24 耳缘静脉采血 12ml，提取血清进行 ELISA 检测和/或 Western blot。d35 第三次
2、免疫，采用 IFA。d45 耳动脉采血 1020ml，提取血清备用。d56 第四次免疫，采用 IFA。d66 耳动脉采血 1020ml，提取血清备用。d76 耳动脉采血 1020ml，提取血清备用。d86 第五次免疫，采用 IFA。d96 颈动脉采血，提取血清，进行 ELISA 检测确定效价和/或 Western blot。另：d0 第一次免疫注射，采用 CFA,免疫前耳缘静脉采血 1 2ml，提取血清作为将来实验的阴性对照。d7 第二次免疫注射 ,采用 CFA。d17 耳缘静脉采血 1 2ml，提取血清进行 ELISA 检测和 /或 Western blot。d28 第三次免疫注射 ,采用
3、IFA。d38 颈动脉采血，提取血清，进行 ELISA 检测确定效价和 /或 Western blot。效价分析：采用 ELISA 法。1. 将磷酸化多肽以包被缓冲液稀释至浓度为 5ug/ml，100ul/孔加入酶标板，4C 过夜或置 37C 45 小时。2. 弃液，以 PBST 洗板 1 次。3. 以 300ul/孔加入封闭缓冲液，置 37C 1 小时。4. 以封闭缓冲液梯度稀释抗血清，稀释倍数从 1000128000 共 7 个梯度，每个梯度300ul，备用；以封闭缓冲液稀释对照血清 1000 倍，备用。5. 以封闭缓冲液稀释免疫原对应的非磷酸化多肽至浓度为 50ug/ml，再以此梯度稀释
4、抗血清，稀释倍数从 1000128000 共 7 个梯度，每个梯度 300ul，备用；稀释对照血清 1000 倍，备用。6. 酶标板弃液，以 PBST 洗板 1 次。7. 将上述稀释的各梯度抗血清和相应的对照血清以 100ul/孔加入酶标板（二复孔） ，37C 置 2 小时。8. 酶标板弃液，以 PBST 洗板 5 次9. 以封闭缓冲液稀释 HRP 标记的抗兔 IgG(根据商品推荐的稀释倍数) ，以 100ul/ml 加入酶标板，置 37C 3060 分钟。10. 弃液，以 PBST 洗板 6 次。11. 以 100ul/孔加入 TMB 显色缓冲液，室温放置显色至合适。12. 以 50ul/孔
5、加入终止液，置酶标仪测读 A450 值。13. 分析 A450 数据，计算各梯度抗血清对应的 A450 与对应的对照血清的 A450 比值，如2,判为阳性，判断对应的稀释倍数为其效价。抗体纯化：Protein G 亲和层析：1. 吸取 Protein G 凝胶装入 P10 柱，以至少 10 倍凝胶体积的 PBS 缓冲液淋洗凝胶。2. 抗血清经过 0.220.45um 滤膜过滤去除颗粒成分，以 PBS 稀释至 2 倍体积。3. 将稀释的抗血清缓慢经过 Protein G 凝胶。4. 以 PBS 淋洗凝胶， （紫外 280nm 检测）至基线平衡。5. 以甘氨酸缓冲液（PH 2.53.5）洗脱并收集
6、蛋白成分（根据 280nm 吸收值）并立即以 Tris 缓冲液调整 PH 至中性。6. 分别以甘氨酸缓冲液（PH 2.53.5）和 PBS（PH 7.2）淋洗凝胶共 2 的循环以活化凝胶，继续用于纯化下一个样品或以 20乙醇平衡后置 4C 保存。7. 纯化的兔 IgG 成分测定 A280 和 A260，并计算其蛋白浓度。非磷酸化多肽柱亲和层析：1. 经 Protein G 亲和层析柱纯化的抗体取适量与非磷酸化多肽连接的凝胶（制备方法见另录）充分混合（室温 2 小时或 4C 过夜） 。2. 将混合物（凝胶与抗体溶液）装入 P10 柱，收集流穿液，以大体积 PBS 淋洗凝胶（280nm 检测）至基
7、线平衡。3. 以甘氨酸缓冲液（PH 2.53.5）洗脱并收集蛋白成分（根据 280nm 吸收值）并立即以 Tris 缓冲液调整 PH 至中性。4. 分别以甘氨酸缓冲液（PH 2.53.5）和 PBS（PH 7.2）淋洗凝胶共 2 的循环以活化凝胶，备用。5. 纯化的蛋白成分测定 A280 和 A260，并计算其蛋白浓度。磷酸化多肽柱亲和层析：1. 将上一步之流穿液与磷酸化多肽连接的凝胶（制备方法见另录）充分混合（室温 2小时或 4C 过夜） 。2. 将混合物（凝胶与抗体溶液）装入 P10 柱，收集流穿液，以大体积 PBS 淋洗凝胶（280nm 检测）至基线平衡。3. 以甘氨酸缓冲液（PH 2.
8、53.5）洗脱并收集蛋白成分（根据 280nm 吸收值）并立即以 Tris 缓冲液调整 PH 至中性。4. 分别以甘氨酸缓冲液（PH 2.53.5）和 PBS（PH 7.2）淋洗凝胶共 2 的循环以活化凝胶，备用。5. 纯化的蛋白成分即为目的抗体，测定 A280 和 A260，并计算其蛋白浓度。（ 必要时进行非磷酸化多肽柱再次亲和层析，方法同前，流穿液即为目的抗体。 ）纯化抗体分析：1. 各纯化步骤之各组分均进行 SDS-PAGE 分析，鉴定其纯度。2. 纯化抗体应进行 ELISA 分析：方法基本同效价分析，需分别鉴定纯化抗体对磷酸化和非磷酸化多肽的最低工作浓度。3. 纯化抗体进行 Western blot 分析：a 将磷酸化和非磷酸化多肽进行 TricineSDS-PAGE,转膜后免疫印迹分析。b 根据文献结果，选择合适的细胞株，进行相应的实验后，收集细胞进行 SDS-PSGE,转膜后进行免疫印迹分析。4. 根据文献结果，选择合适的组织进行免疫组织化学分析。
