1、DNA 提取中实验试剂作用原理 1溶液 I溶菌液： 溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的 -1,4 糖苷键，因而具有溶菌的作用。当溶液中 pH 小于 8 时，溶菌酶作用受到抑制。 葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止 DNA 受机械剪切力作用而降解。 EDTA：（1）螯合 Mg2、 Ca2等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对 DNA 的降解作用（DNase 作用时需要一定的金属离子作辅基）;（2）EDTA 的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。 2溶液 IINaOHSDS 液：NaOH：核酸在 pH 大于 5，小于 9 的溶液中，是
2、稳定的。但当 pH12 或 pH3 时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。在溶液 II 中的 NaOH 浓度为 0.2mo1L，加抽提液时，该系统的 pH 就高达 12.6，因而促使染色体 DNA 与质粒DNA 的变性。 SDS：SDS 是离子型表面活性剂。它主要功能有：（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。 （2）解聚细胞中的核蛋白。 （3）SDS 能与蛋白质结合成为 R-O-SO3-R- 蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是 SDS 能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中（用 RNase 去除RNA 时）受到干扰。
3、 3. 溶液 III-3molL NaAc（pH4.8）溶液：NaAc 的水溶液呈碱性，为了调节 pH 至 4.8，必须加入大量的冰醋酸。所以该溶液实际上是 NaAc-HAc 的缓冲液。用 pH4.8 的 NaAc 溶液是为了把 pH12.6 的抽提液，调回 pH 至中性，使变性的质粒 DNA 能够复性，并能稳定存在。而高盐的 3molL NaAc 有利于变性的大分子染色体 DNA、RNA 以及 SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与 SDS蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。 4为什么用无水乙醇沉淀 DNA？
4、 用无水乙醇沉淀 DNA，这是实验中最常用的沉淀 DNA 的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对 DNA 很安全，因此是理想的沉淀剂。 DNA 溶液是 DNA 以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去 DNA 周围的水分子，使 DNA 失水而易于聚合。一般实验中，是加 2 倍体积的无水乙醇与 DNA 相混合，其乙醇的最终含量占 67左右。因而也可改用 95乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比 95乙醇昂贵） 。但是加 95的乙醇使总体积增大，而 DNA 在溶液中有一定程度的溶解，因而 DNA 损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中
5、的做法是初次沉淀 DNA 时可用 95乙醇代替无水乙醇，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用 0.6 倍体积的异丙醇选择性沉淀 DNA。一般在室温下放置 1530 分钟即可。 5在用乙醇沉淀 DNA 时，为什么一定要加 NaAc 或 NaCl 至最终浓度达 0.10.25mol/L ？ 在 pH 为 8 左右的溶液中，DNA 分子是带负电荷的，加一定浓度的 NaAc 或 NaCl，使 Na+中和 DNA 分子上的负电荷，减少 DNA 分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA 钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分 DNA 形成 DNA 钠盐而聚合，这样就造成 DNA 沉淀不完
6、全，当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好。在沉淀的 DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响 DNA 的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。 6加核糖核酸酶降解核糖核酸后，为什么再要用 SDS 与 KAc 来处理？ 加进去的 RNase 本身是一种蛋白质，为了纯化 DNA，又必须去除之，加 SDS 可使它们成为 SDS-蛋白复合物沉淀，再加 KAc 使这些复合物转变为溶解度更小的钾盐形式的 SDS-蛋白质复合物，使沉淀更加完全。也可用饱和酚、氯仿抽提再沉淀，去除 RNase。在溶液中，有人以 KAc 代替 NaAc，也可以收到较好效果。 7为什么在保存或抽提 DNA 过程中，一般采用 TE 缓冲
7、液？ 在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑 DNA 的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。磷酸盐缓冲系统（pKa7.2）和硼酸系统（pKa=9.24）等虽然也都符合细胞内环境的生理范围(pH) ，可作 DNA 的保存液，但在转化实验时，磷酸根离子的种类及数量将与 Ca2产生 Ca3(PO4)2 沉淀；在 DNA 反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用 Tris-HCl（pKa=8.0）的缓冲系统，由于缓冲液是 TrisH+/Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存 DNA 时，大都采用 Tris-HCl 系统，而 TE 缓冲液中的 EDTA 更能稳定。
