1、 浙江中医药大学生命科学学院 生物化学教研室 蛋白质含量测定 引言 蛋白质的定量分析是生物化学和其他生命学科最常涉及的分析内容 是临床上诊断疾病及检查康复情况的重要指标 也是许多生物制品 药物 食品质量检测的重要指标 在生化实验中 对样品中的蛋白质进行准确可靠的定量分析 则是经常进行的一项非常重要的工作 目前测定蛋白质含量的方法有很多种 下面列出根据蛋白质不同性质建立的一些蛋白质测定方法 物理性质 紫外分光光度法 化学性质 凯氏定氮法 双缩脲法 Lowry法等 染色性质 考马斯亮蓝染色法 银染法 其他性质 免疫比浊法 蛋白质的定量测定 双缩脲法 实验目的要求1 学习分光光度法原理 了解分光光度
2、计的结构 2 掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理及方法 3 了解标准曲线的制作方法及其在物质定量测定中的应用 分光光度法原理 分光光度法 常被用来测定溶液中存在的光吸收物质的浓度 其基本原理是根据Lambert和Beer定律 Lambert定律 一束平行单色光垂直照射于一均匀物质 溶液 时 由于溶液吸收一部分光能 使光的强度减弱 若溶液的浓度不变 则溶液的厚度愈大 光线强度的减弱也愈显著 设 入射光强度为I0L表示溶液的厚度 即光程 出射光 透过光 强度为I根据辐射能理论推导 I0与I之间关系为lg I0 I K1L 1 K1是常数 受光线波长 溶液性质 溶液浓度的影响 Beer定律 当一束单色
3、光通过一溶液时 光能被溶液介质吸收一部分 若溶液的厚度不变 则溶液浓度C愈大 光吸收愈大 透射光线强度的减弱也愈显著 光强度减弱的量与溶液浓度增加量成正比lg I0 I K2C 2 K2为吸收系数 是常数 溶液对光吸收的大小与溶液浓度C成正比 Lambert Beer定律 又称吸收定律 上二式合并 即 l 与 2 合并 lg I0 I CL令A lg I0 I T I I0 则A CL A lgT T为透光率 A为吸光度 光密度 消光度 其中 为常数 又称消光系数 extinctioncoefficient 表示物质对光线吸收的能力 其值因物质种类和光线波长而异 对于相同物质和相同波长的单色光
4、则消光系数不变 分光光度计的结构 光源 钨灯和氢灯 或氘灯 单色器 分解为单一波长光的装置狭缝 调节入射单色光的强度 形成平行光线吸收池 又称比色杯 比色皿 比色池 装待测溶液用检测系统 感受光能 转化为电能 输出A值 T值 本室几类分光光度计 22PC型可见光分光光度计UNICO2000型 S54型紫外分光光度计UV8500型紫外分光光度计 比色杯 比色皿 玻璃比色杯石英比色杯荧光比色杯 比色杯使用注意事项 1 拿取比色皿时 只能用手指接触两侧的毛玻璃 避免接触光学面 2 不得将光学面与硬物或脏物接触 盛装溶液时 高度为比色皿的2 3处即可 光学面如有残液可先用滤纸轻轻吸附 然后再用檫镜纸擦
5、拭 3 比色皿在使用后 应立即用水冲洗干净 必要时可用1 1的盐酸浸泡 然后用水冲洗干净 4 不能将比色皿放在火焰或电炉上进行加热或干燥箱内烘烤 5 在测量时如对比色皿有怀疑 可自行检测 微量移液器 吸嘴装在吸液杆上 应套牢避免间隙 依据所需容量旋转手轮 使数轮显示所需值 轻轻地将推动按钮下压 使推动按钮推移至第一停点位置 手持取液器垂直浸入溶液中 吸嘴浸入深度为2 4mm 停留2 3秒后缓慢放松按钮 即回到原来位置 溶液吸入后稍停即可将吸嘴移出液面 将取液器吸嘴置于排液容器内 使吸嘴尖紧贴容器内壁 按压推动按钮至第二停点位置 使溶液排尽 松开按钮 移液完毕 按压卸嘴按钮 将吸嘴脱卸 实验原理
6、 具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应 因此蛋白质在碱性溶液中 也能与Cu2 形成紫红色络合物 颜色深浅与蛋白质浓度成正比 故可以用来测定蛋白质的浓度 紫红色铜双缩脲复合物分子结构为 但必须注意 此反应并非蛋白质所特有 凡分子内有两个或两个以上的肽键的化合物以及分子内有H2NOC NH CONH2等结构化合物 双缩脲反应也呈阳性 实验材料 1 试剂 1 双缩脲试剂 取1 50g硫酸铜 CuSO4 5H2O 和6 0g酒石酸钾钠 NaKC4H4O6 4H2O 用500mL水溶解 在搅拌下加入300mL10 氢氧化钠溶液 1 0gKI 用水稀释到1000mL 贮存于塑料瓶中 或内壁涂以石蜡
7、的瓶中 避光保存 此试剂可长期保存 若贮存瓶中有黑色或暗红色沉淀出现 则需重新配制 2 标准和待测蛋白质溶液 1 标准蛋白溶液 10mg ml牛血清白蛋白溶液或相同浓度的酪蛋白溶液 用0 05mol L氢氧化钠溶液配制 作为标准用的蛋白质要预先用微量凯氏定氮法测定蛋白质含量 根据其纯度称量 配制成标准溶液 2 待测蛋白质溶液 测定血清等样品时需做适当稀释 使其浓度在标准曲线测试范围内 3 器材试管 试管架 刻度吸管 微量移液器 旋涡混合器 22PC型 UNICO2000型可见分光光度计 S54型 UV 8500型紫外分光光度计 实验方法 1 制作标准曲线取6支干燥洁净试管编号 按下表加入下列试剂 采用标准曲线法 即A540 540nm吸光度值 为纵坐标 蛋白质浓度为横坐标 绘制标准曲线 2 样品测定取2支试管 加入待测样品液各1ml 加入双缩脲试剂4ml 室温下 20 25 放置30min 用分光光度计测定吸光度 3 结果由测得的吸光度在标准曲线上查得样品浓度 以mg ml计 注意事项 1 本实验方法测定范围1 10mg ml蛋白质 2 各管由显色到比色的时间应尽可能一致 3 有大量脂肪性物质同时存在时 会产生浑浊的反应混合物 这时可用乙醇或石油醚使溶液澄清后离心 取上清液再测定 实验报告书写要求 按以下序列书写 1实验目的2实验原理3实验材料4实验步骤5实验结果与分析
