1、第六章 基因组 DNA的提取第六章 基因组 DNA的提取第一节 概 述基因组 DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern 杂交(包括 RFLP)及 PCR分离基因等。利用基因组 DNA较长的特性,可以将其与细胞器或质粒等小分子 DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子 DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中, 可用玻棒将其取出，而小分子 DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部, 从而达到提取的目的。在提取过程中,染色体会发生机械断裂,产生大小不同的片段,因此分离基因组 DNA时应尽量在温和的条件下操作,如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓, 以保证得到较长的 DNA。一般来
2、说,构建基因组文库, 初始 DNA长度必须在 100kb以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行 RFLP和 PCR分析, DNA长度可短至 50kb, 在该长度以上,可保证酶切后产生 RFLP片段(20kb以下),并可保证包含 PCR所扩增的片段(一般 2kb以下)。不同生物（植物、动物、微生物）的基因组 DNA的提取方法有所不同; 不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的 DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法, 以获得可用的 DNA大分子。尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR 反应等有较强的抑制作用,
3、因此用富含这类物质的材料提取基因组 DNA时, 应考虑除去多糖和酚类物质。本实验以水稻幼苗(禾本科)、李(苹果)叶子、动物肌肉组织和大肠杆菌培养物为材料,学习基因组 DNA提取的一般方法。第二节 从植物组织提取基因组 DNA一、材料 水稻幼苗或其它禾本科植物，李（苹果）幼嫩叶子。 二、设备 移液器，冷冻高速离心机，台式高速离心机，水浴锅，陶瓷研钵，50ml 离心管（有盖）及 5ml和 1.5ml离心管，弯成钩状的小玻棒。 三、试剂 1、提取缓冲液：100mmol/L TrisCl, pH8.0, 20mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.5% SDS。 2、提取缓冲液：
4、18.6g 葡萄糖，6.9g 二乙基二硫代碳酸钠，6.0gPVP，240ul 巯基乙醇，加水至 300ml。3、80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇 4、 RnaseA 母液：配方见第一章。 5、其它试剂：液氮、异丙醇、TE 缓冲液，无水乙醇、70%乙醇、3mol/L NaAc。 四、操作步骤：（一）水稻幼苗或其它禾木科植物基因组 DNA提取 1. 在 50ml离心管中加入 20ml提取缓冲液, 60水浴预热。 2. 水稻幼苗或叶子 5-10g, 剪碎, 在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中, 剧烈摇动混匀, 60水浴保温 30-60分钟(时间长,DNA 产量高), 不时摇动。 3. 加
5、入 20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液, 颠倒混匀(需带手套, 防止损伤皮肤)，室温下静置 5-10分钟, 使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。 4. 室温下 5000rpm离心 5分钟。 5. 仔细移取上清液至另一 50ml离心管,加入 1倍体积异丙醇,混匀,室温下放置片刻即出现絮状 DNA沉淀。 6. 在 1.5ml eppendorf中加入 1ml TE。用钩状玻璃棒捞出 DNA絮团,在干净吸水纸上吸干,转入含 TE的离心管中,DNA 很快溶解于TE。 7. 如 DNA不形成絮状沉淀,则可用 5000rpm离心 5分钟, 再将沉淀移入 TE管中。这样收集的沉淀,往往难溶解于 TE,可在 6
6、0水浴放置 15分钟以上，以帮助溶解。 8. 将 DNA溶液 3000rpm离心 5分钟, 上清液倒入干净的 5ml离心管。 9. 加入 5l RNaseA(10g/l), 37 10 分钟, 除去RNA(RNA对 DNA的操作、分析一般无影响，可省略该步骤） 。 10. 加入 1/10体积的 3mol/L NaAc及 2体积的冰乙醇,混匀,-20放置 20分钟左右,DNA 形成絮状沉淀。 11. 用玻棒捞出 DNA沉淀,70%乙醇漂洗,再在干净吸水纸上吸干。12. 将 DNA重溶解于 1ml TE, -20贮存。 13. 取 2l DNA 样品在 0.7% Agarose胶上电泳, 检测 D
7、NA的分子大小。同时取 15l 稀释 20倍, 测定 OD260/OD280, 检测 DNA含量及质量。注意 5g 样品可保证获得 500g DNA, 足供 RFLP、PCR 等分析之用。（二）. 从李(苹果)叶子提取基因组 DNA 1. 取 3-5克嫩叶, 液氮磨成粉状。 2. 加入提取缓冲液10ml, 再研磨至溶浆状。10000rpm, 10min。 3. 去上清液,沉淀加提取液20ml, 混匀。65, 30-60min, 常摇动。 4. 同本节（一）中步骤 3-13操作。?第三节 从动物组织提取基因组 DNA一、材料 哺乳动物新鲜组织。 二、设备 移液管、高速冷冻离心机、台式离心机、水浴
8、锅。 三、试剂 1、分离缓冲液：10mmol/L TrisCl pH7.4, 10mmol/L NaCl, 25mmol/L EDTA。 2、其它试剂：10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml 或粉剂)，乙醚，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，无水乙醇及 70%乙醇，5mol/L NaCl，3mol/L NaAc，TE。 四、操作步骤:1. 切取组织 5g左右,剔除结缔组织,吸水纸吸干血液,剪碎放入研钵(越细越好)。 2. 倒入液氮,磨成粉末,加 10ml分离缓冲液。 3. 加 1ml 10% SDS, 混匀,此时样品变得很粘稠。 4. 加 50ul或 1mg 蛋白酶 K, 37保温 1
9、-2小时, 直到组织完全解体。 5. 加 1ml 5mol/L NaCl, 混匀,5000rpm 离心数秒钟。 6.取上清液于新离心管，用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提。待分层后,3000rpm 离心 5 分钟。7. 取上层水相至干净离心管, 加 2倍体积乙醚抽提(在通风情况下操作)。 8. 移去上层乙醚,保留下层水相。 9. 加 1/10 体积 3mol/L NaAc, 及 2倍体积无水乙醇颠倒混合沉淀 DNA。室温下静止 10-20分钟，DNA 沉淀形成白色絮状物。 10. 用玻棒钩出 DNA沉淀,70%乙醇中漂洗后,在吸水纸上吸干,溶解于 1ml TE中,-20保存。 11
10、. 如果 DNA溶液中有不溶解颗粒,可在 5000rpm短暂离心,取上清; 如要除去其中的 RNA,可加 5l RNaseA(10g/l), 37保温 30分钟, 用酚抽提后, 按步骤 9-10重沉淀 DNA。?第四节 细菌基因组 DNA的制备一、材料 细菌培养物。 二、设备 移液管, 高速冷冻离心机, 台式离心机，水浴锅。 三、试剂 1、CTAB/NaCl 溶液：4.1g NaCl 溶解于 80ml H2 O,缓慢加入10g CTAB,加水至 100ml。 2、其它试剂：氯仿:异戊醇(24:1)，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，异丙醇，70% 乙醇，TE，10% SDS，蛋白酶 K (2
11、0mg/ml 或粉剂)，5mol/L NaCl。 四、操作步骤：1. 100ml 细菌过夜培养液, 5000rpm 离心 10分钟, 去上清液。2. 加 9.5ml TE悬浮沉淀, 并加 0.5ml 10% SDS, 50l 20mg/ml(或 1mg干粉)蛋白酶 K, 混匀, 37保温 1小时。 3. 加 1.5ml 5mol/L NaCl, 混匀。 4. 加 1.5ml CTAB/NaCl溶液, 混匀, 65保温 20分钟。 5. 用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm 离心 10分钟, 将上清液移至干净离心管。 6. 用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提, 取上
12、清液移至干净管中。7. 加 1倍体积异丙醇, 颠倒混合, 室温下静止 10分钟，沉淀DNA。 8. 用玻棒捞出 DNA沉淀, 70%乙醇漂洗后, 吸干,溶解于 1ml TE, -20保存。如 DNA沉淀无法捞出,可 5000rpm离心, 使 DNA沉淀。 9. 如要除去其中的 RNA, 可以按本章第三节中操作步骤处理。 第五节 基因组 DNA的检测上述方法得到的 DNA一般可以用作 Southern, RFLP、PCR 等分析。由于所用材料的不同,得到的 DNA产量及质量均不同,有时 DNA中含有酚类和多糖类物质,会影响酶切和 PCR的效果。所以获得基因组 DNA后,均需检测 DNA的产量和质
13、量。1. DNA 溶液稀释 20-30倍后,测定 OD260 /OD280 比值, 明确DNA的含量和质量。 2. 取 2-5l 在 0.7% agarose胶上电泳, 检测 DNA的分子大小。 3. 取 2g DNA, 用 10单位(U)Hind酶切过夜, 0.7% agarose胶上电泳, 检测能否完全酶解(做 RFLP, DNA必须完全酶解)。如果 DNA中所含杂质多, 不能完全酶切, 或小分子 DNA多, 影响接续的分析和操作,可以用下列方法处理： （1）选用幼嫩植物组织，可减少淀粉类的含量。 （2） 酚:氯仿抽提, 去除蛋白质和多糖。 （3）Sepharose 柱过滤, 去除酚类、多糖和小分子 DNA。 （4）CsCl 梯度离心, 去除杂质, 分离大片段 DNA(可用作文库构建)。*JimiSoft: Unregistered Software ONLY Convert Part Of File! Read Help To Know How To Register.*
