1、第一部分防腐挑战实验调研结果1实验样品样本要求新鲜，没有被微生物污染，一般每个样本为300g2微生物挑战性实验 2.1实验菌株不同国家、组织、企业对挑战实验选择白测试菌种有一定差异（如表1）,国内参照美国化妆品、香精和洗涤剂协会（ CTFA）推荐的菌种（因其较具代表性，如表2所示），所以更为恰当。（注意菌株来源问题：同属一个种的细菌来源不同，菌株不同，MIC值不同）表1某些国家、组织、企业用于化妆品微生物挑战试验的测试菌株美国美国 英国德国德国菌株（药典）（ISP公司）（药典） （Henkel公司） （S&M 公司）白假丝酵母黑曲霉红色青霉绿色木霉绳状青霉大肠埃希氏菌镉绿假单胞菌金黄色葡萄球菌
2、粪肠球菌产气肠杆菌表皮葡萄球菌日勾维肠杆菌洋葱假单胞菌肺炎克雷伯氏菌恶臭假单胞菌荧光假单胞菌表2 CTFA化妆品微生物挑战试验的菌株选择革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌表皮葡萄球国肺炎克雷伯氏菌至少省-种阴沟肠杆菌发酵革兰氏阴性杆菌大肠埃希氏菌至少选两种变形菌属日勾维肠杆菌铜绿假单胞菌洋葱假单胞菌非发酵革兰氏阴性杆菌荧光假单胞菌恶臭假单胞菌至少省-种黄杆菌属不动杆菌属酵母白假丝酵母近平滑假丝酵母至少省-种霉菌黑曲霉黄绿青霉至少省-种产芽抱菌枯草芽抱杆菌供选用生产现场分离菌适当菌株一种以上2.2 培养基牛肉膏蛋白胨培养基、琼脂培养基2.3 试验用菌液的配置（ 1）标准悬液的配制1%硫酸9.9ml与1%
3、氯化钢0.1ml,混合后配制成的悬液浓度为3X108cfu/ml, 此悬液再做3 倍稀释。（ 2）细菌菌悬液的配制实验前将菌株接种到各个培养基斜面上， 36 摄氏度恒温培养48 小时。将已培养好的活性菌种，用灭菌生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡摇匀。 用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作稀释，浊度和标准悬液的浊度（3x108cfu/ml）相同为止；此时的稀释菌液再做3倍稀释，即为所需的1xi08cfu/ml的菌悬液，做细菌 总数确定细菌数。（ 3）霉菌菌悬液的配制将已培养好的活性菌种， 用灭菌的生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中， 充分振荡摇匀；用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作依次的 10 倍稀释，每次的稀释
4、用血球计数板计数，必须5个中格的霉菌总数在190210,落在此范围内的菌悬液为我 们所需的1 x 108cfu/ml的霉菌菌悬液，做霉菌总数确定霉菌数。2.4 接种2.4.1 接种方式（ 1）单菌接种：每种测试菌株单独做一个挑战试验。这种方法的优点是容易了解每种微生物对防腐体系的敏感性， 在筛选产品的防腐体系时有较好的参考价值，但工作量大、费时、费工，和产品的实际污染菌情况也有差距（因来自自然界的微生物常常不是单一的种类） 。（ 2）混合菌接种：西欧、德国等的许多国家和企业多采用这种方式，除了因工作量相对较小外，这种接种方法更能代表污染的状况。2.4.2 接种次数和时间（ 1）一次接种：只是在
5、试验开始时接种一次，整个试验周期28 天。 （一次加菌的 28 天微生物挑战实验）（ 2）多次接种：在试验开始接种一次后 （重复加菌的微生物挑战实验）a 法：第 21 天再接种一次，试验周期为 28 天。 （有实验表明，第 21 天接菌和不接菌时，第 28 天时的微生物含量并无显著的差别，评定结果也相同）b 法：每隔两周接种一下，连续三次（即第 1、 3、 5 周接菌，每两周接菌前分离一次） ，试验周期为 49 天；c 法：每周接种一次，连续5 次，试验周期为 35 天。 （ S&M 公司的资料介绍，采用此种方法评价认可的防腐体系，可保证产品 30个月内的防腐安全）2.4.3 操作方法称取待测
6、样品30g,对应加入0.3ml浓度为1X1071xi08cfu/ml的细菌悬液及霉菌悬液，用干净的无菌勺子搅拌均匀后盖上保鲜膜，细菌在32.5 2.5的培养箱中培养，霉菌在22.5 2.5的培养箱中培养。a.水溶性样品10g 加入 90ml 无菌生理盐水，稀释后取1ml 样品液，加入9ml 灭菌生理盐水中，做依次稀释，分别为10-1、 10-2、 10-3、 10-4、 10-5、 10-6、 10-7 等稀释度；取三个合适稀释度的样液， 分别吸取 1ml 样液加入已灭菌的平皿中， 做菌落计数， 并做两个平行。b.油溶性样品取 10g 样品，加入10ml 无菌吐温 -80 和 10ml 无菌白
7、矿油，再加70ml 无菌生理盐水，用无菌玻棒充分混匀；吸取 1ml 已稀释的样品液， 加入 9ml 灭菌生理盐水中， 做依次稀释， 分别为 10-1、 10-2、 10-3、 10-4、 10-5、 10-6、 10-7等稀释度；取三个合适稀释度的样液，分 别吸取 1ml 加入已灭菌的平皿中，做菌落计数，并做两个平行。2.5 培养细菌放在32.5 2.5的培养箱中培养；霉菌在22.5 2.5的培养箱中培养；混合菌在28的培养箱中培养。2.6 菌落计数分别在0、 7、 14、 21、 28 天分离计算样品中活的细菌、霉菌；每次计算完细菌总数、霉菌总数后将平皿放回培养箱， 以待下次观察用， 观察中
8、切勿打开平皿，以免燃菌而使下次无法观察。菌落计数的标准方法：先选取平均菌落数在30300之间的平皿作为细菌菌落总数测定范围，选取平均菌落数在550之间的平皿作为霉菌菌落总数测定范围；有两个稀释度在30300之间，求比值。若比值0 2,报告平均数；若比值2，以其中较小的稀释度计算细菌总数；所有稀释度都大于300，以稀释度最高的平均菌落数计算；所有稀释度都小于30，以稀释度最低的平均菌落数计算；所有稀释度均在30300之外，其中一个大于300,而相邻的加一稀释度小于30，则以最接近30 或 300 的平均菌落数计算；若平皿中有连成片状或花点样菌落蔓延生长时，不宜计算；若片状菌落不到平皿中的一半，
9、而另一半中菌落均匀， 则可将此平皿菌落计数后X2,以报告全皿菌落数。2.7 评价标准2.7.1 CTFA 推荐的一次加菌防腐挑战性试验及评价标准CTFA 的方法初始的霉菌和细菌的接种量分别为 10000cfu/g （ ml ）和1000000cfu/g（ ml ） （ CFU 为菌落单位） ，要求在第7 天时霉菌降低90%，细菌降低 99.9%，并且在28天内菌数持续下降。2.7.2 美国评价标准在CTFA评价方法的基础上提出的标准，如表 3所示。表3美国所用一次加菌的微生物防腐挑战实验评价标准评价标准一次加菌的28天微生物挑战实验防腐效果优良若单菌接种的三个平行试验中任何一种微生物数量的平均
10、值，口在第七天时下降到 100 cfu/g （ml）以下，第28天全部为0。J防腐效果勉强通过若单菌接种的三个平行试验中任何一种微生物数量的平均值，一在第七天时下降到 1000 cfu/g （ml）以下。防腐效果无效若单菌接种的任何一种微生物，任何一个平行样达不到上述标准，也达不到 CTFA的要求。2.7.3 国内评价标准国内参照CTFA加菌防腐挑战性评价标准。表4国内所用微生物防腐挑战实验评价标准评价标准一次加菌的28天微生物挑战 实验重复加菌的微生物挑战实验防腐效果优良（W）第28天化妆品中存货的细菌数量10CFU/ml ,说明该样品 防腐体系对细菌后较强的抑 杀效果。在二次加菌后，在每次
11、加菌的 第14天样品中存货的细菌数100CFU/ml防腐效果尚可（M）第28天化妆品中存货的细菌数量100CFU/ml ,说明该样 品防腐体系对细菌有一定的 抑杀效果。在二次加菌后，在每次加菌的 第14天样品中存货的细菌数100CFU/ml ,说明该样 品防腐体系对细菌有较差的 抑杀效果。在二次加菌后，在每次加菌的 第14天样品中存货的细菌数 1000CFU/ml第二部分实验室可采取的方案1实验样品2微生物挑战性实验2.1 实验菌株金黄葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、白假丝酵母、枯草芽抱杆 菌2.2 培养基牛肉膏蛋白陈培养基2.3 试验用菌液的配置实验前，将各菌株接种于合
12、适的培养基中，于 37 C （细菌）和28 C （霉菌）培养箱中培养。细菌培养2天，霉菌培养5天后，挑选典型的菌落于灭菌的生理盐水中，制成一定浓度的混合细菌（10A8CFU/ml ）和霉菌悬液（10A6CFU/ml ）,置于4c冰箱储藏备用。2.4 一次加菌的28天微生物挑战实验量取样品30ml分别加0.3ml混合菌悬液，使得细菌浓度为10A670A7CFU/ml ,霉菌浓度为10A470A5CFU/ml ,充分混匀。将样品在 28摄氏度下保存，在接菌 0、7、14、21、28d取 样品分析含菌量（培养计数法）。2.6 评价标准评价标准一次加菌的28天微生物挑战实验防腐效果优良（W）第28天化
13、妆品中存货的细菌数量10CFU/ml ,说明该样品防腐体系对细菌有较强的抑杀效果。防腐效果尚可（M）第28天化妆品中存货的细菌数量100CFU/ml ,说明该样品防腐体系对细菌有较差的抑杀效果。附：实验中所需的仪器和药品设备名称需求数量要求用途1冰箱1易清洁消毒存放困种、标准悬液2电子秤1易清洁消毒样品重量测试3浊度仪1易清洁消毒检测细菌菌悬液之浓度4无菌操作台1易清洁消毒微生物实验用，要求等级10000级5生化培养箱3易清洁消毒细菌、毒菌培养各1台；保存琼脂为液 体状态及紧急烘干器皿，需用1台6显微镜1易清洁消毒霉菌总数观测用7移液枪21001000 uL移取菌液用；备用8恒温水浴锅1易清洁
14、消毒用于油性样品之充分溶解，规格待定9自动灭菌锅1自动物品灭菌用10牛角勺100称取样品用；备用11酒精灯2无菌操作台配套用；备用12200ml烧杯10盛装样品用；备用13500ml烧杯10盛装样品用；备用14150ml三角烧瓶10盛装样品用；备用1510ml试管100配备案子盛装无菌生理盐水；备用16移液枪枪尖100移液枪配套用；备用17:皿200 （套）细菌、霉菌总数测定用；备用18血细胞计数板2霉菌计数用；备用19革兰氏染色配套盒1革兰氏染色用20普通营养琼脂10瓶装自配培养基用；备用21虎红琼脂10瓶装自配培养基用；备用22氯化钠2分析纯自配生理盐水用；备用23硫酸1分析纯用于配置标准悬液24氯化钢1分析纯用于配置标准悬液25保鲜膜2保存样品用；备用
