1、中国海洋大学 硕士学位论文褐藻胶酶解寡糖的制备、分离和结构鉴定姓名：张真庆申请学位级别：硕士专业：生药学指导教师：管华诗2003.6.1酶解褐藻胶寡糖的制备、分离和结构鉴定目的：本论文利用菌株勿从i。510产生的褐藻胶裂解醒降解褐藻胶，探讨酶解得到褐藻胶寡糖的生产工艺，及分离纯化褐藻胶寡糖以得到相应标准品从而丰 富海洋寡糖库，以此为基本目的和出发点，并且为探讨该褐藻胶裂解酶酶解行为、 酶解位点，做先期的工作。方法；应用紫外法与DNS法对该褐藻胶裂合酶的酶 活进行测定。应用紫外扫描法、凝胶渗透色谱技术(HPGPCTSK G2500PWxl)和聚丙烯酰胺凝胶电泳法(PAGE)对不同时间酶解产物组分
2、的分子量及相对含 量加以分析。对酶解寡糖进行分离纯化:应用凝胶过滤色谱法(Bio-Gel P-4; P-6)、快速液相色阴离子交换色谱法(Q-Sepharose. Fast Flow),其间应用新技术谱仪(FPLC)对分离条件进行优化和确定。对所得寡糖应用灌注色谱技术(HQ-20)检测其纯度，并应用此方法进一步纯化；同时运用荧光辅助糖电泳(FACE)和高效毛细管电泳(HPCE)技术作为进一步检测纯度的方法。应用ESI-MS、NMR等对得到的寡糖进行结构鉴定。结果：本文应用紫外法和DNS法对该酶的酶活进行检测，从海藻中筛选出的菌株为6再。510所产褐藻胶裂解酶 有较高的比活力：22.5unit/
3、mL。HPGPC和PAGE方法对褐藻胶的降解程度有良 好的检测效果，快捷、高分辨率和直观是这两种方法的共同点。凝胶渗透色谱与 阴离子交换色谱均对褐藻胶寡糖有良好的分离效果，得到四个组分。经灌注层析 进一步纯化，应用FACE和HPCE检测二糖为一结构单的化合物，三糖到五糖 均有异构体的存在。应用ESI-MS确证四个组分分别为二糖到五糖，且聚合度单 一。同时对结构单一的二糖利用】H-NMR, -C-CMR,比丁七HNjQC和中官 COSY进行了结构昼磐非还原端存在双键的古罗糖醛酸二壁。讨论：一方 面，通过进一步的分离纯化得到单一结构的化合物五对单体结构进行分析确定 的同时，所得结果将会为酶解行为特
4、点的确定提供必要的信息，以便于对酶解工 艺作进一步的指导；另一方面得到较高聚合度的寡糖，并进行活性的筛选。关键词：褐藻胶裂解酶寡糖分离纯化结构分析Preparation, Isolation and Structure elucidation of alginate oligomers degraded by the alginate lyaseAbstractThis thesis mainly involved the producing technics and preparation of alginate oligomers degraded by an alginate lyase
5、, which was produced by a stain Vibrio 510 selected from algae, as markers. Another aim of preparation is enrichment of library of marine oligosaccharides. At the same time isolation purification and structure confirming of these blocks is the first stage of determination of action pattern of the ly
6、ase. The alginate lyase has higher specific activity of 22.5unit/mL. Analysis of the degree of degradation by UV scan, HPGPC and PAGE, analysis of samples molecular and percent of every fraction by HPGPC, in which series TSK G3000PWXl and TSK G2500PWxl was applied, are the foundation of producing te
7、chnics of alginate oligomers. Isolation and purification of alginate oligomers: Gel filter chromatography (Bio-Gel P*4, P-6) and anion exchange chromatography(Q- sepharose Fast Flow) were applied, in which fast performance liquid chromatography (FPLC) was applied and there are good results. Four blo
8、cks (dp: 2-5) were got from the end products of enzyme hydrolysis. Each of the four blocks showed one peak on perfusion chromatography with HQ20*poros with the purity at least 85%97%, And the molecular were confirmed by ESI-MS. The structure of the block of dp2 was confirmed by !H-NMR, UC-NMR, lH-BC
9、 HQMC and 厄-吧 COSY. But the block of dp3 showed two or three bands in fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis (FACE) And both other two blocks show not only one peak in HPCE. Its the infections of isomers confirmed by NMR. This will be one of the most important information for determinatio
10、n of action pattern of the alginate lyaseKeywords: alginateoligosa ccharid eslyase isolation purificationstructure analysis醉解褐藻胶其糖的制备、分离和结构鉴定、寡糖的活性研究进展及海洋寡糖的潜在应用价值寡糖（0/次05。叱/小4口）一般是由3-10个单糖分子通过糖昔键连接而成的网。糖类物质在六十年代以前被普遍认为只是一种能源和结构物质，但近些年来随着 分子生物学、医学等前沿和交叉科学的发展，人们渐渐认识到糖类物质不仅仅只 作为能量和结构物质存在，它与蛋白质一样也可作为一种
11、信息物质存在。特别是寡糖,它广泛的存在于生命体内，主要是以糖缀合物的形式参与许多生命活动, 而这些糖缀合物在发挥生物学功能的过程中起决定作用的往往就是那些寡糖残 基网。现已发现在激素、抗体、维生素、生长素和其他各种生物大分子中都有寡 膜表面都覆盖有寡糖，这些寡糖在细胞正常或不正常的识别过程中都发挥着重要 的作用【久可以说寡糖在生物体大分子及细胞间的相互作用过程中发挥着一种 信号的功能，起着一种桥梁的作用。寡糖由于单糖分子、结合位置和结合类型的 不同，种类繁多，功能各异。基于以上所述，寡糖有着多种重要的生物活性，加 之其在食品工业上的应用与发展，因此有关寡糖的研究及应用已成为结构化学、 分子生物
12、学、医学和食品学的新兴研究领域。本文将从抗凝、抗病毒、提高免疫 力、抗肿瘤和食品学等几个方面对寡糖及其复合物的活性研究进展进行阐述。海 洋是生命的最初发源地，在海洋生物中存在着大量具有特殊作用的活性物质。糖的存在。寡糖也存在于细胞膜中寡糖链突出于细胞膜的表面，使整个细胞内外的研究成果表明海洋生物的多样性及其生物活性物质化学结构的多样性远 远超过了陆生生物，以海洋生物作为药物开发的资源具有非常广泛的前景四 所谓海洋性寡糖是指来源于海洋的寡糖，以几丁寡糖、褐藻寡糖、卡拉胶和琼胶 寡糖等为代表，它们来源丰富，结构独特，在结构特点方面与内源性寡糖有很多 形似点，有着巨大的开发潜力。（I）抗凝活性聚阴离
13、子寡糖有着良好的抗凝活性。研究发现了大量副作用较小的抗凝剂， 其中以低分子量肝素（LMWH）最为突出，还有硫酸软骨素bUL合成二麦芽 糖酰氨酸.、二乳糖酰氨酸皿以及与抗凝血酶m（atiii）结合的肝素五糖四等。肝素与ATHI结合的部分为一独特的五糖结构，约占自然肝素的三分之一以下, 称为核心五糖】。当低分子量肝素（包括核心五糖）与AHII结合，后者被激活, 直接与凝血酶Xa因子作用产生抗凝作用。当在普通肝素存在下，除了凝血酶Xa 因子以外，IL因子还可与肝素和ATHI形成的复合物结合（主要通过自然肝素较 长的糖链），同时产生抗凝活性和出血副作用。所以LMWH与许多寡糖有 较小的副作用。寡糖保持
14、了较好的抗凝活性，又有较小的副作用，而且它有了合 成的可能性，可以得到单一化合物，符合当今药物开发的大趋势。海洋性寡糖来 源丰富、结构简单、生产工艺简便，其中管华诗院士以褐藻胶为基础研制的PSS 系列第二代产品6聚甘酯与内源性寡糖（即肝素核心五糖部分）在结构和活性 方面有很多相似点口”作为一种成品药已经显示出了良好的市场竞争力。（2）抗病毒活性寡糖有着很强的抗病毒活性，特别是近年来有诸多报道寡糖对HIV有很好的抑制作用0早在1964年就有人发现肝素对单纯疱疹病毒HSV有抑制作用1, 所以我们在研究过程中往往以类肝素物质为出发点，对各种天然及人工修饰的硫 酸多糖的抗病毒活性进行探讨。但当我们对其
15、反应机理及其构效进行深入的研究 时，却发现正如与Ann结合的肝素核心部分为一特定五糖结构一样“叫在抗病 毒过程中同样是有某一段有特定结构的寡糖在起着关键作用皿2八22. 23。在实际姓基存在的情况下的研发过程中单独的寡糖抗病毒活性较低，而在有疏水基 则有很好的抗病毒活性。海洋性寡糖有较强的抗病毒作用（硫酸化十二烷基五昆 布糖ED$o可达到0.1即g/mL而硫酸化十八烷六麦芽糖、硫酸化十二烷五乳糖 ED5。为040.7阳7mD映2对说明其结构的独特性起到了至关重要的作用。普遍认为硫酸化烷基寡糖抗HIV的作用机制可分为两方面：一是，硫酸化寡糖与病毒 细胞膜上的gpl20糖蛋白有专一反应，gpl20
16、是病毒与T淋巴细胞表面HIV受 体分子CD4特异结合的部分，这样就阻止了 HIV病毒颗粒向CD+ T-细胞膜的吸附，抑制病毒诱导的合体细胞的形成，而合体细胞的形成是艾滋病人CD十八细胞 衰竭的重要原因，消除了 HIV引起的细胞病变磔】；一是，烷基部分与表面活性剂类似，可与病毒囊膜脂质双层作用，起到固定寡糖，甚至破坏囊膜的作用a” 当然寡糖与多糖一样，硫酸基的引入对其抗病毒作用有着至关重要的作用网。此外，有报道岩藻依聚糖、卡拉胶在体外都有很好的抗病毒的作用【峋，虽然它们都是多聚物但也为我们研究海洋性寡糖类抗病毒药物提供了坚实的依据。 （3）提高免疫力、抗肿瘤活性1986年，Suzuki等】通过对
17、BALB/C白鼠腹腔注射聚合度为4-7的几丁寡糖发现腹膜渗出液的细胞（PEC）数量明显增加，其中PEC主要由一种巨噬细多形核白细胞（PMN）组成，并认为PMN表面存在N-乙酰-D-葡萄糖残基受体，几丁寡糖和受体结合后激活PMN,从而激活机体免疫系统。1998年,Kudryashov等冈利用唾液酸L/构型寡糖的免疫原性加上细胞毒性物质设计了 一种肿瘤疫苗，引起了广泛的注意,这可能成为我们新的克服癌症的突破口。1998 年，Suzuki等网认为；某些具有GlcNAc或GlcN的寡糖与巨噬细胞上受体结合 后，激活后者，使其释放IL1,同时引起细胞表面IL-2受体表达，而这又加 速了 T细胞成熟而释放
18、IL2, IL2与受体结合后，进一步加速了 T细胞分化成熟为细胞毒性T细胞，通过这种相互之间的协同作用从而产生抗肿瘤作用。寡 糖的抗肿瘤作用和抗感染能力在很大程度上是通过提高机体的免疫力来实现的， 寡糖本身并无细胞毒性，这就是它作为抗肿瘤和抗感染药物潜在的毒副作用大大 降低。大量的报道和事实证明卬，海洋性寡糖壳寡糖在活机体免疫系统的方面 有着很强的活性因3习。在作为功能食品和药物等方面有着很大的开发潜力。但 从抗癌方面来讲，除了几丁寡糖外，褐藻寡糖（Mblocks、MG-bl0CkS）.岩藻 寡糖都已引起人们的足够重视，前者可激活单核细胞产生间接的肿瘤细胞毒性 1281 ；后者在肿瘤的发生发展
19、过程中有不同的表达，所以外源性的岩藻寡糖可作 为一种肿瘤疫苗或其前体加以利用【29。海洋性寡糖在提高机体免疫力、抗肿瘤 方面有着很大的发展前景，这与其独特的天然结构以及与内源性物质的相似性有 密不可分的关系。（4）抗炎活性炎症反应的起始过程是由择凝素（selectin），一种能与碳水化合物结合的受体所调控的31。择凝素是一类处于细胞表面的生物受体，它能够识别特定的寡 糖分子，并与之结合从而实现细胞间的识别与选择性结合。目前发现的与免疫反 应有关的择凝素共有三种类型：E-, P-和L-择凝素动物模型显示所有三类择凝素均在急、慢性炎症中发挥作用，但在不同情况下那种择凝素其主要作用却有所不同。研究发
20、现一类同时能被三类择凝素识别的四糖结构Sialy Lewis xsLex, NeuAc a -2, 3 Gal B -L 4 （Fuc a -L 3 ） GlcNAc （1）和 Sialy LewisasLea, Neu Ac a -2, 3 Gal P -1, 3 (Fuc a -1, 4) GlcNAc40O这两种寡糖的区别仅在于它们分子中半乳糖基和岩藻糖基与N-乙酰氨基葡萄糖的连接方式不 同，但其空间取向相似。虽然sLe*与择凝素在体外结合较弱，但其的确具有显 著的抗炎效果。现已进入临床。除了上面所讲到的sLeX、sL及其类似物和肝素寡糖外，海洋性寡糖在抗炎方面有着很好的发展潜力。首先褐
21、藻胶是以甘露糖醛酸（M）和古罗糖醛酸（G） 嵌合而成，它与sLex中唾液酸有着相同的竣基，不同的片断有着不同的构象, 这为以褐藻胶寡糖为原料研制新型抗炎药物提供了有力的理论支持：岩藻寡糖是 另一类有潜在应用价值的海洋性寡糖，sL/和sL,结构中有岩藻糖单体的存在。寡糖的抗炎作用机制在理论上有了深入的研究，但在实际应用上sLex和sLl的 合成有一定难度，成本较高，海洋性寡糖来源丰富，结构相对简单理论上是sLesL和肝素寡糖的良好替代品，有着良好的潜在应用价值。（5）其他方面的应用由于人体不具备分解、消化寡糖的酶系统，在摄入之后，它很少或根本不产生热量，而且，一些寡糖如异麦芽寡糖、蔗果低聚糖、乳
22、果低聚糖具有一定程度 的甜味，因此可代替蔗糖等食用糖，不会影响食品原有的风味，并可有效的防止 肥胖、高血压、糖尿病等。海洋性寡糖中几丁寡糖以其来源丰富、良好的活性、 简便的制备方法等众多因素引起了人们的重视，并在很多方面加以应用。因其可癖解褐藻胶寡糖的制备、分尚和结构鉴定 .一-T.广泛激活免疫系统、又可以作为双岐因子142),据研究，许多功能性低聚糖如大 豆低聚糖、低聚葡萄糖、低聚木糖、低聚半乳糖、几丁寡糖等不能为肠道中的产 气荚膜杆菌和梭菌利用,.但能使双歧杆菌增值10/00倍，故称为双歧因子。几 丁寡糖在功能食品中被广泛的作为功能因子，取得了良好的效果。值得一提的是褐藻寡糖有较强的促进植
23、物生长的功能和抗菌作用I；可以作为肥料的响应剂；提高植物的抗冻能力；蜗牛生长促进剂：头发生长促进剂。根据褐藻胶的抗菌作用，它还被应用于牙科；又因为褐藻胶是一种有一定粘度的 高分子聚合物，褐藻胶本身常被应用于药物胶囊，在起到缓释同时有抗菌和免疫r7V障的作用由)。褐藻胶降解产物也用于化工行业，如作为印染材料的成分；添 加到墨水李提高墨水的喷墨及打印质量；作为酚嘎嗪染料的稳定组分等闽,随着人们对海洋开发的不断深入,我们对来海洋性寡糖的认识也越来越全面和深刻。海洋是生命的发源地，这在一定程度上佐证了海洋性寡糖与机体内源性 物质有很多的相似之处，并为开发海洋性寡糖的活性提供了依据；海洋又是目前 低等生
24、物的聚居区，海洋性寡糖在结构上较简单，这为我们提取分离、分析检验 提供了便利条件。我国有丰富的海洋资源，目前被开发利用的部分寥寥，海洋性 寡糖有着巨大的开发潜力，这将成为未来几年我们开发海洋的一个方向。总之, 寡糖在医学、食品、乃至畜牧、化工领域受到了越来越广泛的瞩目。寡糖在自然 界中分布之广，结构之复杂，活性之多是我们对其开发研究的基础；糖化学的分 离、提纯、合成和分子生物学、医学研究的不断深入，又是我们对其开发利用的 有利保障。随着寡糖在生物体内的重要作用渐渐被人们所揭示，对寡糖的开发利 用价值R益体现，其应用前景十分广阔。相信不久的将来，寡糖类药物包括寡糖 类功能食品将在我们的生活中占有
25、重要的地位。随着科学的发展和研究的不断深入，从多糖到寡糖，它们的生物活性和在工业上的应用得到了广泛的认可。特别是寡糖在结构方面较多糖更为确定，所以有 更多的发展潜力。海洋性寡糖特别是褐藻胶寡糖，就像上文中提到的，是一种非 常有研究价值的系列寡糖。在世界范围内，褐藻胶的降解、分离和产物的活性正 被广泛的研究。褐藻胶简介褐藻胶是褐藻细胞壁的主要组成物质之一,它在藻体中含量高,且用途广泛,具有重要的工业应用价值。据1996统计，全世界的褐藻胶总年产量30 000t，价值约2.5亿美元。在研究早期因为褐藻胶有一定的粘度，它被广泛的应用于食 品、纺织、生物、医药、发酵等工业叫 随着医学和分子生物学的发展
26、，糖类 药物已被广泛的认知，这为褐藻胶的应用开拓了新的领域。褐藻胶是一种直链多糖，它的结构是以B -甘露糖醛酸和a -古罗糖醛酸为单 5陶解褐潦胶寡糖的制备、分离和结构鉴定体通过14糖昔键连接而成的。从整个分子来看褐藻胶可分为三种段落聚甘露糖醛酸(M block聚古罗糖醛酸(G block)和甘露糖醛酸古罗糖醛酸杂合段(MG block)o在褐藻胶中甘露糖醛酸与古罗糖醛酸的比值根据藻类不同、地域不同、 季节不同及在藻类中分布部位不同而呈现差异网，大致为2:1至10，甘露糖醛酸是以le-4e两个平伏键的糖音键连接成多糖链，其构象接近晶体结构中的双折叠螺旋体状，两个糖醛酸单体以104&重复，连接成
27、片状结构，两 甘露糖醛酸的0(5)和O(3)-H存在链内氢键，因0(5)是一个环内氧，故氢键较弱, 使聚甘露糖醛酸段形成具有一定柔性的链状分子。连接古罗糖醛酸之间的糖昔键 呈直立状，并在0(2)和0(6)之间以链内氢键结合，在空间上氢键作用力较大， 使聚古罗糖醛酸段形成了具有一定刚性的分子。褐藻胶在天然状态下，是以游离 酸、钠盐、钾盐及二价盐(以钙盐为主)的形式存在的，商品褐藻胶是以钠盐为 主，当钙盐存在时褐藻胶将形成“蛋盒”结构，因为钙离子通过古罗糖醛酸残基将众多的糖链联接成网状结构。00OH NaOOCGGMMFigure L Structure of alginate褐藻胶在大分子状态粘
28、度和稳定性，应用于医药、食品和化工工业中。近年来，褐藻胶寡糖在提高免疫力及促进植物生长等方面有诸多报道，引起了人们的关注。得到寡糖的主要办法是降解和分离，将不同聚合度和不同M/G的寡糖纯化作为筛选活性物质的原料药，对探索新的活性物质和海洋寡糖库的丰富和积累都起着重要的作用。三、褐藻胶的降解褐藻胶是一种高聚合度的多糖类物质，根据其分子量不同应用在不同的领域。当褐藻胶以高聚合度状态存在，往往利用其高粘度及较高的稳定性等物理性质应用在食品、化工和医药等领域；当褐藻胶被降解后，经过分离修饰后往往会 呈现出各种生物活，性继而被开发成药物，如PSS、甘糖酯、D，聚甘酯等。随着 分子生物学和医学的发展，寡糖
29、的生物活性引起了世人的瞩目，随之而来的问题 就是降解，如何降解，降解到何种程度。(1)氧化降解双氧水降解：在高温或催化剂存在下，褐藻胶能够被双氧水降解成寡糖，反应过程简单，成本较低，但降解条件比较剧烈，而且对所得寡糖的还原端有一定 的破坏作用。此外其它氧化剂，如次氯酸钠等：在催化剂的存在下也可发生降解，获得寡 糖。(2)酸降解稀酸常压条件下只能将褐藻胶初步降解，并且是在MG杂合段降解，所以是一种降解分离M段和G段的方法。文献中报道，在加压的条件下褐藻胶将被降 解成为寡糖。(3)碱降解碱降解的机理是B-消除法：在碱性条件下C-5上的质子容易被夺走，由于 竣基的诱导效应，C4位上的电子向C5为转移
30、，使1-4糖昔键断裂，达到降解 的目的。同时降解产物45位上形成了一个与竣基共扼的双键。(4)裂合酶降解酶是一类具有特殊效能的催化剂，可以在极其复杂的体系中作用于特定的物 质。20世纪以来，随着酶学理论的发展，蛋白质(酶)分离纯化技术的进步， 微生物发酵工艺不断更新，也由于发酵和酶合成调解理论步步深化，从而使酶制 剂研究工作迅速向前推进。酶有着催化效率高、专一性强、对环境极其敏感但反 应条件温和等方面的优势。酶作为生物催化剂已广泛的应用于食品、医学、纺织、 制革等各个工业生产领域，在海洋药物研究开发方面也越来越显示出明显的优越 性。裂合酶的种类和来源: 褐藻胶裂合酶亦称褐藻酸酶，它主要分为1，
31、4-古罗糖醛酸裂合酶、1, 4.甘露糖醛酸裂合酶，分别作用于古罗糖酸酸段额和甘露糖醛酸段。褐藻胶裂合酶主 要来源于海洋软体动物(marine mollusks )、棘皮动物(echinoderms)的消化腺及海洋细菌、真菌等。据文献报道，1974年Lyudmila A.等从软体动物(痴妩littorina中分离出了褐藻胶酶。在弧菌(Vibro sp.Al-9 ( Vibro sp.ALl28)46f ( Vibroalginolyticus AACC17749)刈；黄杆菌(Ftavobacferiam multivolum)； Alginovibeioaquatili；固氮菌加de，vinel
32、andii)1501 ；克里伯克菌(K/e加aerogenes)7醉解褐藻胶寡糖的制备、分离和结构鉴定0，(Klebsiella pneumoniae2 假 单胞菌(Pseudomonas alginovora ), (Pseudomonas aeruginosa53 t 肠杆菌 Enterobacter cloacae M-l) 54；别单胞菌(Alteromanas sp.)网；芽抱杆菌(3g7出scirculans5 ； Agarbacterium9中都分离出褐藻胶裂合酶。虽然合藻胶酶的来源丰富，能将其工业化的寥寥无几，因为酶的分离纯化成本太高，无法大量从软体动物的消化腺中分离纯化，也无
33、法从海洋细菌的发酵液 中分离纯化得到高专一性的酶制品。随着分子生物学的发展，新的解决办法应运 而生，1991年，BJBrown等网报道了用基因工程的方法从褐藻附生生物分离的(Sargrssum fluitans),将甘露糖醛酸裂解酶基因克隆到大肠杆菌中表达，生产甘露糖醛酸裂解酶。另夕卜 Pseudomonas sp.OS-ALG-9t59 Pseudomonas alginobora, Klebsiella pneumoniae6Pseudomonas aervg加。的褐藻胶裂合酶的基因也被定序并克隆到大肠杆菌中用于生产褐藻胶裂合酶，甘露糖醛酸裂 解酶，古罗糖醛酸裂解酶。1993年，Malis
34、sard等网把海洋细菌ATCC433367 的基因克隆到E.coli生产甘露糖醛酸裂合酶发酵液产酶50u g/L。有关微生物褐藻胶裂褐酶的基因克隆和结构研究代表了这一领域最新、最重要的进展。通过将褐藻胶裂合酶的基因克隆到适于工业化生产的宿主细胞，可使 褐藻胶裂褐酶的发酵产率得到大幅提高。此外，对褐藻胶裂褐酶结构的详细了解 为基因的克隆提供了必要的信息的同时，使合适的酶在工业化生产中得到应用成 为可能。毫无疑问，微生物褐藻胶裂合酶的基因克隆对酶的生产产生和褐藻胶寡 糖的结构鉴定方面深远的影响。褐藻胶裂合酶专一性作用原理:COONaCOONaCOONaCOONaFigure2, The mecha
35、nism of enzymic degradation褐藻胶裂合酶降解褐藻胶的原理与碱解的B 消除法相似65、的：第一步,醉解福藻胶寡糖的制备、分离和结构鉴定裂合酶的活性位点中碱性氨基酸愈合藻胶的竣基结合形成一个盐桥形式；第二 步，由于诱导效应C-5位上的电子迁移，质子丢失；第三步，C-4位上的电子向05迁移，同时1, 4糖昔键断裂，非还原端形成C% 5位双键。C, 5不饱和双键与殷基形成共匏，在230240nm有强烈的紫外吸收。酶解产物寡糖(oligosaccharide)的分离纯化方法:随着寡糖在分子生物学等领域得到关注，天然寡糖的分离纯化在近期也得到了巨大的发展。褐藻胶寡糖的组成合连接相
36、对简单，但它同样继承了糖链的微观 不均一性等方面的高度复杂性，因此选择合适的方法对混合糖链进行分离，是一 项摸索性很强的工作。目前的分离手段有很多种主要的进展分述如下:(1)褐藻胶的分级Haug等】(1966)将褐藻胶用lmol/L草酸于100C进行部分水解，样品的大约30%溶解，离心分离出的不溶部分为聚合度20-30的低聚糖，将其溶解，于pH2.85时产生沉淀，分离，可溶部分中含80%-90%甘露糖醛酸，不溶部分含0%-90%古罗糖醛酸。纪明侯等68(1983年)进一步证实，PH2.85是分离甘露糖醛酸和古罗糖醛酸的重要技术参数之一。(2)分步沉降法不同分子量的低聚糖，在不同浓度的低级醇或酮
37、中溶解度不同，利用这一点 可将样品进行初步的分离。在低浓度的低级醇或酮中聚合度大的样品沉淀出来, 增加低级醇或酮的浓度聚合度低的样品沉淀出来，这样以达到分布沉降的目的。(3)膜分离技术网膜分离是指借助膜的选择渗透作用，在外界能量或化学位差的作用下对混合物的溶质和溶液进行膜分离，该技术应用于多糖和寡糖的分离纯化的主要有超 滤、渗析等。超滤是利用筛分原理以压力差为推动力的膜分离技术，主要用于浓 缩、分级、大分子溶液的净化的等。渗析又称透析是根据筛分和吸附扩散原理, 主要是利用膜两侧的浓度差使小分子通过对称微孔膜得到交换，而大分子被截留 的过程，随着超滤技术的发展，渗析技术正在逐渐被取代，现在多数用
38、于血液渗 析和除盐等。(4)凝胶色谱法凝胶色谱是以分子筛原理根据低聚糖的聚合度和构型进行分离纯化。凝胶色 谱是目前分离纯化生物大分子最常用的方法之一。常采用的凝胶有Sepherdex系 列如G.10, G-15, G-25等，在最近的文献中，Superdex 30】有较好的分离效果, 且分离范围较宽。在寡糖分离纯化领域中Bio-Gel P-2, P-4, P-6,P-10等是最为常用，效果也最好的凝胶系列。 (5)离子交换色谱法7】离子交换色谱法用于带电核寡糖的分离纯化，它的原理是凝胶上接有离子基团可与带有相反性质电荷的样品结合，当用buffer洗脱时不同电荷密度的样品依 次被洗脱。在分离蛋白
39、等生物大分子中离子交换色谱法，是一种最常用的方法,近年来她被移植到酸性糖的分离纯化领域中，并得到较好的效果。常用的离子交 换凝胶有DEAE, Q, Monoq, SAX等系列。(6)聚丙烯酰胺凝胶电泳法(PAGE)73 73、74、75聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种研究低聚糖的新技术，它是根据样品的核质比以 聚丙烯酰胺凝胶慰介质以电压为动力达到分离的目的。该法样品用量少(一般在10-50ug),重复性强，可比性好(每次可上样10个)，主要用于分析样品分子量,检测样品纯度。由于褐藻胶寡糖的电荷较少，无法用用阿利新蓝等适用于酸 性多糖的染色剂对其染色，所以在PAGE的基础上引入荧光辅助糖电泳法 (Flu
40、orophore-assisted carbohydrate electrophoresis, FACE),即在寡糖的还原端接 上荧光试剂时起在紫外光线下有吸收，便于检测. FACE相对于PAGE分辨率进 一步提高，更有利于分析和检测。(7)醋酸纤维膜电泳醋酸纤维模电泳是一种根据样品中电荷数不同，产生不同的电迁移率达到分 离纯化目的的方法，主要用于分析硫酸化多糖。(8)效液相色谱法(HPLC)便、7& 77高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）法是一种高效率、高分辨率的分离纯化手段。它往往应用于分离纯化后期，主要作为分析鉴 定的
41、方法。根据所需不同，可选择凝胶柱或离子交换柱，在有制备柱的条件下可 做少量的制备。(9)高效毛细管电泳(HPCE) 78791高效毛细管电泳以其快速、高效、便捷、高分辨率及样品和溶剂消耗少等优点在最近十几年内正为分离和分析生物活性物质的有力工具之一。HPCE虽然可以分为 CZE（Capillary zone electrophoresis,毛细管区带电泳）、CGE（Capillary gel electrophoresis,毛细管凝胶电泳）、MECC（Micellar electrokinetic capillary chromatography,胶束电动毛细管电泳）、CEC（Capillar
42、y electrochromatography,毛细管电色谱)、CIEF(Capillary isoelectrofbcusing,毛细管等电聚焦)和 CITP(Capillary isotachophoresis,毛细管等速电泳)等六中分离模式，但目前在糖化学中常用的仅前三种模式。其原理是不同的溶质在均一的缓冲溶液体系中根据其电泳淌度的不同而分离成为独立的区带。与FACE相同，可在样品上接荧光物质13解解渴糠放寡糖的制各、分离和结构鉴定以提高灵敏度。(10)其它色谱学方法快速制备液相色谱仪(Fast Protein Liquid Chromatography FPLC)顾名思义是一种快速的液
43、相色谱制备仪器，适用于中低压条件，可从分析放大到制备。它 以人工智能化软件相匹配，方便、快捷、准确是它显著特点。近年来，FPLC得 到了大力的发展，可基本代替常压和中亚的柱层析。灌注层析网(Perfusion Chromatography )是近年来发展起来的新型色谱技术它打破了传统的流速、分辨率和容量间的三角关系，即以流速增加的情况下，柱 容量，分辨率均不会降低，且压力降也不会升高，使快速分离纯化生物大分子成 为可能。因为灌注层析适用于高压所以其作用可代替HPLC,流速范围大在一台 仪器上可同时进行分析和制备。不管是FPLC还是灌注层析，都有与之相配合的硬件和带有人工智能的软件系统，有最优化
44、自动模板系统用于方法设定，在几十分钟内完成系统化试验，以 便迅速的找到最佳操作条件，为有效和快速的纯化生物大分子提供保证。此外，还有其相色谱，离子色谱，石墨化碳柱网】的高压液相色谱等技术可以应用到底聚糖的分离研究中。虽然低聚糖的分离纯化方法很多，但其依然是一 项复杂而困难的工作，对于不同结构性质的低聚糖需采取不同的分离方法。探索 和是的分离方法及实验条件是寡糖研究中非常重要的内容之一。五、寡糖的结构分析技术寡糖由于单糖分子、结合位置和结合类型的不同，使得种类繁多，功能各异,鉴于糖缀合物上寡糖链在生命过程中的重要作用，展开寡糖链的结构分析是非常 重要的。传统的低聚糖分析方法主要是化学方法，如甲基
45、化分析，Smith降解, 过碘酸氧化、乙酰化、三氧化珞氧化法。随着现在分析技术的进步，几种先进的 物理学方法已经应用到寡糖的结构分析上来，如红外(IR)、核磁共振Ch-nmr, 13C-NMR, COSY等)、质谱(MS)等，这些方法使低聚糖的结构分析有了质的 飞跃。(1)红外光谱(IR)红外光谱是有机化学和高分子化学研究中不可缺少的工具，它可为我们提供 官能团及氢键的相关信息。以褐藻胶为例在1600cm/有羟基盐的吸收峰： 甘露糖醛酸和古罗糖醛酸分别在808cm”和787cm-1有特征吸收峰，二者的峰面 积比可作为测定M/G比值的方法之一。15酶解揭藻胶寡糖的制备、分离和结构鉴定(2)圆二色
46、谱（CD）Morris等（1973）测定了多聚甘露糖醛酸和富古罗糖醛酸的圆二色谱图，可从212nm （古罗糖醛酸特征）与200nm （甘露糖醛酸特征）谷与峰的高度，即分子椭圆度(molecular ellipticity ) , 6 , (degree cm】 dmo）相对比较,求出M/G17比值。（3）核磁共振（NMR）NMR对多糖和寡糖的结构分析是十分重要的，它分析样品用量少且无破坏性，高分辨率的】H-NMR能准确测定结构表征基团的化学位移，精度可达0.001ppm。糖链的各种结构特征，均可由这些结构表征基团的微小变化表现出来。傅 立叶技术的应用促使碳谱的常规化，使其可于氢谱相媲美，这两种
47、核磁相互补充在结构测定方面相得益彰。近年来随着超导核磁的普及，种类繁多的二维核磁技 术得到了广泛的应用。在糖链的结构分析中，综合运用这些技术可以获得单糖的 种类、异头构型、糖昔键位置、非糖取代基位置、单糖连接顺序等一级结构的丰 富信息。如果将其于经典的甲基化分析、部分降解等方法联合应用，可大大加快 糖连接结构研究的进程。就褐藻胶为例，HNMR可以辨认还原端的异头质子, 据次可推断M/G比值；根据糖残基一位上质子的化学位移微小差异可推断糖苗 键的类型及糖残基的排列顺序。（4）质谱（MS）质谱是目前寡糖序列分析的常用方法之一。由于其灵敏度高，药品用量少， 在糖分析中得以广泛应用。质谱不仅可用于鉴定甲基化分析产物从而确定单糖残 基间的连接顺序,近年来，快原子轰击质谱（FABMS）、电喷雾电离质谱（ESIMS）、 基质辅助基光解析质谱（MALDI-MS）、基质辅助激光解析飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）在测定糖的分子量和糖连的一级结构方面得到广泛的应用。Dr. Yan Liu （2000）】用ESI-MS对低聚褐藻胶寡糖进行分析得到良好的效果;Shimokawa等（1996）】用FAB-MS对褐藻胶寡糖进行分析，采用负离子方式得到良好的结果。寡糖的结构和活性研究，已经成为诸
