1、2018/6/19,1,Genomic DNA Extraction from Mammal Tissue,哺乳动物组织基因组DNA提取,2018/6/19,2,一、实验目的(Experimental Purpose),After the experiment is finished, students should be able to extract genomic DNA from mammal tissue, and to run an agarose gel.,1.掌握动物基因组DNA提取的操作方法。2.掌握琼脂糖凝胶电泳的操作的方法。,2018/6/19,3,二、实验原理(Expe
2、rimental Principle),The detergents SDS ( sodium dodecyl sulfate) is added to denature proteins and solubilize lipids in membranes leading to cell lysis . The cell lysate is often treated with enzymes that hydrolyze RNA and proteins.,本实验利用去垢剂SDS(十二烷基磺酸钠)是为了使蛋白变性并溶解细胞膜中的脂质从而导致细胞裂解，而细胞裂解物又常用蛋白酶K进行水解处理。
3、,2018/6/19,4,真核生物染色体DNA组装不同层次的结构,2018/6/19,5,Then they are treated with phenol and chloroform to remove the remaining proteins, which will either enter the organic phase or, if they had denatured, appear at the interphase. Alcohol help to concentrate the DNA while removing nucleotides, amino acids,
4、oligonucleotides and peptides.,随后用酚氯仿进行抽提，以去除残留的蛋白质，这时蛋白质将进入有机相，或者假如己变性的话将呈现在有机相与水相之间。乙醇沉淀处理则可以浓缩DNA，同时去除核苷酸、氨基酸以及低分子量的寡核苷酸和肽。,2018/6/19,6,We can add the eathylene diamine tetraacetic acid (EDTA) to keep the integrity of DNA. EDTA can chelate Mg2+ and reduce deoxyribonuclease (DNase) activity, becau
5、se these enzymes require Mg2+ to work.,为了进一步保护DNA样品的完整性，通常需要在缓冲液中添加乙二胺四乙酸(EDTA)以整合Mg2+，这样将会减少脱氧核糖核酸酶(DNase)的活性，因为该酶必须在有Mg2+存在时才会起作用。,2018/6/19,7,本实验方法分离得到的染色体DNA长度为100-150kb，适用于构建基因组文库和Southern杂交分析。如果要求得到较大分子量的DNA，则必须省略其中的振荡步骤。,2018/6/19,8,核酸的分离纯化、测定及研究方法,一、 分离核酸的一般原则 因为遗传信息全部贮存在核酸的一级结构中，故完整的一级结构是保证
6、核酸结构与功能研究的基础。,2018/6/19,9,（一）核酸的分离和纯化时应遵循两个原则 保证核酸一级结构的完整性； 排除其它分子的污染。,（二）核酸的纯度要求 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子； 其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度； 排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时，应去除RNA，反之亦然。,2018/6/19,10,（三）核酸分离纯化的注意事项,为保证分离核酸的完整性和纯度，在实验中应注意： 尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏； 减少化学物质对核酸的降解，为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破
7、坏，操作多在pH410条件下进行； 防止核酸的生物降解。细胞内或外来的各种核酸酶水解核酸链中的磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构。其中DNA酶需要金属二价阳离子Mg2+，Ca2+的激活，因此使用金属离子螯合剂，如EDTA或柠檬酸盐等基本上可以抑制DNA酶的活性。而RNA酶不但分布广泛、极易污染样品，而且耐高温、耐酸碱、不易失活，所以生物降解是RNA提取过程中的主要危害因素； 减少物理因素对核酸的降解，物理降解因素主要是机械剪切力，其次是高温。,2018/6/19,11,高温：如长时间煮沸，除水沸腾带来的剪切力外，高温本身对核酸分子中的某些化合键也有破坏作用。核酸提取过程中常规操作温度为04以降
8、低核酸酶的活性从而减少对核酸的生物降解。 机械剪切力：包括强力高速的溶液振荡、搅拌，细胞突然置于低渗液中；细胞爆炸式地破裂及DNA样品的反复冻融等。这些操作细节在实验操作中应加倍注意。机械剪切作用的主要危害对象是大分子量的线性DNA分子，如真核细胞的染色体DNA等。,2018/6/19,12,二、核酸分离纯化的一般步骤,破碎细胞去除蛋白质、多糖、脂类等生物大分子沉淀核酸去除盐类、有机溶剂等杂质纯化干燥溶解。核酸提取方案，应根据具体生物材料和待提取核酸分子的特点而定。对于某特定细胞器中富集的核酸分子，采用先提取细胞器后再提取目的核酸分子的方案，可获得完整性和纯度两方面质量均高的核酸分子。,201
9、8/6/19,13,三、试剂与器材(Reagents and apparatus),. Instruments High speed refrigerated centrifuge（高速冷冻离心机）、 Glass homogenizer（玻璃匀浆器）、 Electrophoresis System（电泳系统）、 Ultraviolet transilluminator（紫外透射仪）、Ultra cold storage freezer（超低温冰箱）、Autoclave（高压灭菌锅）、 Pipettes（微量加样器）、Electronic balance（电子天平）、Acidometer（酸度计
10、）,2018/6/19,14,. Material Liver of rabbite,2018/6/19,15,. Reagents,Tris、SDS、EDTA、 HCl、 NaOH 、 Sodium acetate (NaAc)、 Acetic acid (HAc)、Phenol、Chloroform、Ethanol、Isoamylol、TE buffer 、Protease K、RNase A、Agarose、DNA molecular weight markers 、Boric acid、Sugar、Bromophenol blue、Fluorescent dye (Gelview),2
11、018/6/19,16,1. 5 molL NaCl 2. 1 molL Tris HCl pH8.03. 0.5 molL EDTA pH8.0 4. dddH2O 5. 3 molL NaAc pH5.2 6. 生理盐水（0.85 NaCl） 7. 10SDS 8. 5TBE 9. 10mgmL蛋白酶K -20保存 10. 10mgmL无DNA酶的RNA酶 -20保存11. 6凝胶加样缓冲液,（一）储备液的制备,四、实验步骤 (Experimental Procedures),2018/6/19,17,四、实验步骤(Experimental Procedures),冰浴处理生理盐水 玻璃匀
12、浆器 冰冷的生理盐水清洗（3次）配制工作液 称取0.2g肝脏 剪碎 组织匀浆液 酶解液2ml匀浆液 组织细胞液 玻璃匀浆器匀浆 移至1.5ml离心管 5000rmin3060s 加400ul 吹散 加400ul 离心 无菌水 酶解液 水浴处理（55、1218h）,（二） 破碎、酶解细胞（过夜）,4,弃上清,2018/6/19,18,四、实验步骤(Experimental Procedures),等量分装在两支离心管内 加入20ul的RNase 加入等体积提取液(翻转混匀) 4 10min酶解样品 待抽提的样品 抽提 静置 离心 配制 TE缓冲液 加等体积提取液500ul10000rmin离心1
13、0min 4 10min 移出水相 至离心管 抽提 静置 10000rmin离心10min 加1/10 加2倍 放入离心 移出水相 NaAc 无水乙醇 -20 1-2h 12000rmin离心15min 加入超低温冰箱 融化、离心 弃上清液 洗涤 12000rmin离心15min 干燥 混匀75%冷乙醇 离心 弃上清液 加TE50ul,（三） 抽提DNA 、乙醇沉淀纯化DNA,37 水浴1h,DNA(4 存放),2018/6/19,19,四、实验步骤(Experimental Procedures),Agarose Gel Electrophoresis ： Preparation of th
14、e gel 制备0.3琼脂糖凝胶 Loading DNA samples DNA samples 16l + Loading buffer4l Gel 电压120V Gel photography,（四） 、琼脂糖凝胶电泳检测DNA,2018/6/19,20,1.制备 0.3 琼脂糖凝胶。称取 0.06 g 琼脂糖，放人锥形瓶中，加入 20 mL的 0.5TBE 缓冲液，放入微波炉加热至完全溶化，则为 0.3 琼脂糖凝胶液。（由于蒸发作用，溶解前在容量瓶上作一个记号，溶解后用三蒸水补足）2.制胶器的安装。3.将熔化的琼脂糖凝胶液转入Gelview专用的三角瓶中，然后加入Gelview 2l。4
15、. 将冷到60左右，缓缓倒入制胶器(注意不要形成气泡)。5. 待胶凝固后（80min），轻轻拔掉梳子，将凝胶盘从制胶槽中取出，放入电泳槽内。6. 加入电泳缓冲液(0.5)至电泳槽中。,2018/6/19,21,5TBE（电泳缓冲液） 100mL,5.4gTris，2.75g硼酸， 2mL 0.5mol/L EDTA(pH8.0)加蒸馏水到100mlpH8.0,0.5TBE,2018/6/19,22,6上样缓冲液,025溴酚蓝：取60ml三蒸水，将250mg溴酚蓝溶解于其中40(WV)蔗糖水溶液：在上述溶液中加入40g蔗糖,2018/6/19,23,Illuminate the gel with
16、 UV light and then take pictures. By comparing product bands with bands from the known molecular-weight markers, you should be able to identify any product fragments which are of the appropriate molecular weight.,通过紫外透射仪检测凝胶，然后获取图片。并将产物条带与已知分子量的标淮条带进行比较，便可以对合适分子量大小的产物进行鉴定。,2018/6/19,24,五、实验结果(experi
17、mental results),2018/6/19,25,哺乳动物基因组DNA的提取 （综合性实验报告）,六、实验报告,2018/6/19,26,溶液的配制,摩尔质量的计算:质量(g)分子量 5 molL NaCl 分子量58.44 x58.44(1) 5mol/L氯化钠（NaCl）： 溶解14.6g氯化钠于足量的水中，定容至50ml。,0.05(L) 5（mol/L） x 14.61（g）,体积(L) 摩尔体积（mol/L）,2018/6/19,27,(2) 0.5mol/L乙二胺四乙酸（EDTA）: 配制等摩尔的Na2EDTA和NaOH溶液（0.5mol/L），混合后形成EDTA的三钠盐。
18、或称取9.31g的Na2EDTA2H2O和1g的NaOH，pH调至8.0，并溶于约40ml水中，定容至50ml 。（3) 3mol/L乙酸钠（NaAc）： 溶解20.4g的三水乙酸钠于约40ml水中，用冰乙酸调溶液的pH至5.2，再加水定容到50ml 。,2018/6/19,28,(4) 10十二烷基硫酸钠（SDS）： 称取5gSDS慢慢转移到约含40ml的水的烧杯中，用磁力搅拌器搅拌直至完全溶解。用水定容至50ml 。(5) 40%氢氧化钠（NaOH）： 溶解40g氢氧化钠颗粒于约90ml水的烧杯中（磁力搅拌器搅拌），氢氧化钠完全溶解后用水定容至100ml 。(6) 1mol/L盐酸（HCl
19、）： 加8.6ml的浓盐酸至91.4ml的水中。,2018/6/19,29,(7) 20mg/ml蛋白酶K（proteinase K）： 将200mg的蛋白酶k加入到9.5ml水中，轻轻摇动，直至蛋白酶K完全溶解。不要涡旋混合。加水定容到10ml，然后分装成小份贮存于-20。(8) 10mg/mlRnase（无DNase）（DNasefree RNase）： 溶解10mg的胰蛋白RNA酶于1ml的10mmol/L的乙酸钠水溶液中（pH 5.0）。溶解后于水浴中煮沸15min，使DNA酶失活。用1mol/L的TrisHCl调pH至7.5，于-20贮存。（配制过程中要戴手套）,2018/6/19,
20、30,(9) 1 molL Tris缓冲液（TrisHCl buffer）,将121g的Tris碱溶解于约0.9L水中，再根据所要求的pH（25下）加一定量的浓盐酸（11.6N），用水调整终体积至1L。,2018/6/19,31,(10)5TBE（电泳缓冲液） 100mL,5.4gTris， 2.75g硼酸， 2mL 0.5molL EDTA(pH8.0)加蒸馏水到100mL pH8.0,(11) 6上样缓冲液,0.25溴酚蓝：取60ml双蒸水，将250mg溴酚蓝溶解于其中 40(WV)蔗糖水溶液：在上述溶液中加入40g蔗糖,2018/6/19,32,（12）组织匀浆液 （装入10ml离心管中
21、） 10ml,100mmolL NaCl：0.2ml（5M NaCl）25 mmolL EDTA(pH8.0)： 0.5ml（ 0.5M EDTA pH8.0)l0mmolL Tris HCIpH 8.0)：0.1ml（1M Tris HCIpH 8.0)加三蒸水: 9.2ml,计算方法：5 molL NaCl 100mmolL 5 molL x 0.1molL 10ml 0.2ml,2018/6/19,33,（13） 酶解液（装入1.5ml离心管中） 1ml,200mmolL NaCl：0.04ml （5M NaCl）50mmolL EDTA(pH 8.0)：0.1ml （0.5M EDTA
22、 pH8.0) 20mmolL TrisHCl(pH 8.0)：0.02ml（1M Tris HCIpH 8.0)1SDS：0.5ml（2 SDS）200gmL蛋白酶K：0.02ml（10mgmL） 加三蒸水: 0.32ml,2018/6/19,34,（14）提取液1 ：平衡酚(pH8.0)：氯仿：异戊醇 （25：24：1）,即配即用 每管加500ul 平衡酚(pH8.0)： 250ul 氯仿： 240ul 异戊醇： 10ul,（15）提取液2 ：氯仿：异戊醇（24：1）,即配即用 每支试管加 500 ul 氯仿： 480ul 异戊醇： 20ul,2018/6/19,35,（16）TE缓冲液：5ml,10mmolL Tris HCl(pH 8.0)： 0.05ml（1M L TrisHCI pH 8.0)1mmolL EDTA(PH80)： 0.01ml（ 0.5M EDTA pH8.0)加三蒸水至4.94mL,2018/6/19,36,酚抽提除去蛋白质的示意图,2018/6/19,37,核酸的沉淀,原理：核酸与钠、钾、镁形成的盐在许多有机溶剂中不溶，也不会变性。醋酸钠为沉淀DNA、RNA的最常用盐类。有机溶剂：乙醇、异丙醇、聚乙二醇。温度：冰水,
