1、独创性声明学位论文题目：几种常用实验动物与人肠道主要菌群多样性比较本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加 了特别标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同 仁在文中作了明确说明并表示衷心感谢。学位论文作者：龙江7签字日期：年J月7日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的 规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘， 允许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院（筹）可以将学 位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或扫描等复
2、制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：不保密， 口保密期限至 年 月止） 学位论文作者签名：才归 导师签名：签字日期：年6月 初 签字日期：21年 0J日犍栅理学硕士学位论文几种常用实验动物与人肠道主要菌群多样性比较动物学专业硕士研究生李伟指导教师魏泓教授本研究受国家“973”重点基础研究发展计划：感染微生态动 物模型的建立、评价及应用(2007CB513007)资助。西南大学生命科学学院二零一一年五月中国重庆Master DissertationComparison of the diversity of the faecal microbiota amon
3、g laboratory mouse, rat, :miniature pig and humanMajor: Zoology Author: Li Wei Supervisor: Wei HongThis work was supported by grants from the National Basic Research Program of China ( 2007CB513007).个School of Life Science, Southwest UniversityChongqing ChinaMay 10,2011摘要IAbstractIll第1章文献综述11前言 12肠道
4、微生物的功能：22.1 扬道微生物与营养22.2 扬道微生物与代谢22.3 肠道微生物与免疫 23肠道微生态研究现状、方法及近些年研究技术进展33.1 基于16SrRNA基因的分子生态学技术 33.2 元基因组技术 33.3 代谢组学技术 54肠道菌群与人体健康和疾病54.1 与人类共生的肠道菌群54.2 肠道微生态与健康64.3 肠道微生态与疾病65肠道微生态的研究前景6第2章 几种常用实验动物与人肠道主要菌群多样性比较111引言112实验材料122.1 实验动物和志愿者122.2 主要试剂 1223主要仪器设备132.4主要试剂及溶液配制143实验方法153.1 实验动物的选取和健康志愿者
5、选择153.2 取样153.3 粪便菌群总DNA的提取153.4 PCR 扩增163.5 DGGE电泳及染色 193.6 DGGE凝胶图像分析193.7 统计学分析204实验结果204.1 FVB/n小鼠和BALB/c小鼠肠道菌群PCR-DGGE比较分析204.2 SD大鼠和Wister大鼠肠道菌群PCR-DGGE比较分析264.3 贵州小型猪和巴马香猪肠道菌群PCR-DGGE比较分析324.4 小鼠、大鼠、小型猪与人肠道菌群PCR-DGGE比较分析385讨 论44参考文献47致 谢51在读期间所发表的文章53在读期间参加科研情况53英文缩写一览表英文缩写英文全称中文全称SDSprague-D
6、awleySD大鼠16S rDNA16S ribosomal DNA gene16s核糖体DNA编码基因PCRPolymerase chain reaction聚合酶铢式反应PBSPhosphate-buftered Saline磷酸缓冲盐水DGGEDenaturing Gradient Gel-Electrophoresis变性梯度凝胶电泳RNAaseRibonucleaseRNA酶TEMEDN ,N.N ,N -tetramethylenediamineN,N,NN、四甲基乙二胺TETris-EDTA (buffer)Tris/EDTA (缓冲液)DDWDouble-distilled w
7、ater双蒸水dpBase pair碱朝PCRPolymerase Chain Reaction聚合酶锥式反应dNTPDeoxyribonucleoside triphosphates脱氧核糖核甘三磷酸TrisTris(hydroxymethyl)Amino-methane三羟甲基氨基甲烷APAmmonium persulfate过硫酸技EDTAEthylene diaminetetra aceticacid乙二胺四乙酸SDSSodium dodecyl sulfate十二烷基磺酸钠UPGMAUnweighted Pair Group Method with非加权配对聚类分析Arithmeti
8、c Mean西南大学硬十学位论文几种常用实验动物与人肠道主要菌群多样性比较动物学专业硕士研究生李伟指导教师：魏泓教授摘要人类是由10%的人体细胞和90%的微生物细胞共同组成的“超级生物体” 人的肠道中栖息着大约103个，1000多种微生物，是人和动物体最庞大而复杂的 生物群落，其主要分为与宿主共生的生理性细菌（类杆菌、双歧杆菌属、拟杆菌 等），与宿主共栖的条件性致病菌（肠肝菌、肠球菌等）以及大多数为过路菌的病 原菌（变形杆菌、霍乱弧菌、痢疾杆菌等），主要分布在结肠部位，正常情况下肠 道菌群保持着共生和拮抗关系，从消化、营养吸收、能量供应、脂肪代谢、免疫 调节、药物代谢和毒性等诸多方面影响人和动
9、物的健康状况2，对于肠道微生态的研究，传统的方法是通过微生物的选择性培养，或者是通 过直接形态学观察来获得部分信息，再进行鉴定和分类。传统培养方法的局限性 在于培养过程费时费力，易受操作方法的影响，敏感度低,大多数微生物很难或 不能用现有的技术分离培养；培养技术只能定性检测可培养的细菌，不能鉴定未 知的细菌，不能正确的反映肠道微生物群体的数量和多样性，使人类不能全面了 解肠道微生物之间和与宿主的相互关系，阻碍了人类对肠道微生物的认识。近年 来，随着分子生物学技术的迅猛发展，分子生物学技术在微生态学中的应用也日 益广泛，其特点是能够快速获得微生物种群定性、定量数据，这使得微生态学现 有的研究范围
10、得以进一步扩展。以16S rRNA基因为基础的变性梯度凝胶电泳 （denaturing gradient gel electrophoresis. DGGE）技术能够快速准确地鉴定在自然环 境或人工环境中的微生物种群，并进行复杂微生物群结构演替规律研究，以及生 物种群的动态分析6。特别是近几年来国内外学者采用不同的分子生物学方法对细 菌的16S rRNA进行研究，已经得到了广泛的16S rRNA序列数据库，为我们进行 该比较微生态的研究提供了基础。目前用于肠道微生态研究的实验动物主要是用大/小鼠来建立的，其优点是个 体小、易于操作、繁殖速度快、价格便宜等等，但是啮齿类与物在解剖、生理和 代谢等
11、方面与人之间存在较大的差异，在肠道微生态研究上并不能很好的作为模 型动物，而就生理学、解剖学和营养代谢等方面小型猪与人更为相似，并且人的 一些疾病如肝硬化，糖尿病、高血压和一些营养代谢症等在其身上也有发生，目 前以小型猪作为实验材料的文章也越来越多。本研究利用PCR-DGGE技术对常用 实验动物：FVB/n 小鼠、BALB/c 小鼠、SD （Sprague-Dawley）大鼠、Wister 大鼠、 巴马香猪、贵州小型猪与人的肠道总菌群、乳杆菌属菌群、拟杆菌属菌群进行了 肠道菌群的多样性、丰富度和均匀度以及UPGMA相似性聚类分析，研究目的和意义通过比较微生态的方法，间接和直接阐明几种常用实验小
12、鼠、大鼠、小型猪 与人的肠道主要菌群在多样性的差异，正确反映它们作为常用模型动物与人之间 肠道菌群的差异和相似性，初步分析上述几种常用医学实验动物肠道菌群的特点 和差异，期望为肠道微生态研究提供基础性资料，以及在选择肠道微生态研究用 模型动物时提供参考依据。研究方法1 .收集健康成年小鼠（FVB/n和BALB/c）、大鼠（SD和Wister）、小型猪（巴 马香猪和贵州小型猪）和人的粪便样品，提取总菌DNA；2 .分别用V3 （总菌）引物，lac （乳杆菌属）、bfr （拟杆菌属）二种特异性引物 引物扩增提取到的肠道菌群总DNA、乳杆菌属菌群DNA和拟杆菌属菌群 DNA；3 .分组进行变性梯度凝
13、胶电泳（DGGE）；4 .对每张电泳胶上的条带,利用spssU.O分析软件进行数据分析。研究结果利用PCRQEEG方法，对两个品系小鼠，两种大鼠，两种小型猪，以及小鼠、 大鼠、小型猪与人之间肠道总菌群、乳杆菌属和拟杆菌属的多样性、丰富度和均 匀度分析，结昊显示各种属内没有显著性差异，在种属间存在显著性差异，从肠 道菌群同源性分析，小鼠、大鼠、小型猪的肠道总菌群、乳杆菌属菌群与人的比 较，小型猪肠道菌群与人的最为接近，拟杆菌属比较实验动物之间比较接近。关键词：实验动物肠道菌群多样性PCR-DGGEI!AbstractComparison of the diversity of the faeca
14、lmicrobiota among laboratory mouse, rat,miniature pig and humanMajor: ZoologyAuthor: Li WeiSupervisor: Wei HongAbstractBackgroundThe human being is the super organism5 composed by 10% human body cells and 90% microorganism cells. The human endogenous gut microflora is an immensely diverse ecosystem
15、and approximately 1014, 1000 kinds of microorganisms inhabiting there. Gastro-intestine was divided into physiological symbiosis with the host bacteria (eg. Bacteroidaceae. Bifidobacterium. Bacteroidetess, etc) and the conditions of the host symbiotic bacteria, based mainly on facultative anaerobes
16、(eg. intestinal coli, enterococci etc.) and the majority passing bacteria pathogens (eg. Proteus, Vibrio cholerae, Shigella, etc.) The intestinal tract bacteria are mainly in the colon area, all of which are maintaining symbiotic and antagonistic relationship. In digestion, nutrient absorption, ener
17、gy supply, fat metabolism, immune regulation, drug metabolism, toxicity, and many other aspects they have an effect on human and animafs health.For the study of intestinal microflora, the traditional method is through selective cultivation of microorganisms, or by direct morphological observation to
18、 get some information, and then identify and classify them. However, these methods have limits such as: they are laborious and vulnerable to the impact of operating methods; the sensitivity is low; most microorganisms are difficult to or cant be isolated or cultured by using existing technologies. T
19、he raising technology could oniy culture qualitative detection of bacteria and can identify the unknown bacteria. As a result, it cannot correctly reflect both the number of intestinal microbial population and the diversity and in西南火学硕士学位论文further makes human beings not fully understand the relation
20、ship between the host and the intestinal microflora. In recent years, with the rapid development of molecular biology, molecular biology techniques in micro-ecology are increasingly widespread, which is characterized by microbial population quickly obtaining qualitative and quantitative date. It mak
21、es micro-ecology of the existing research range be further expanded. The 16S rRNA gene-based denaturing gradient gel electrophoresis (denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE) leuluiiques quickly and accurately identify the natural environment or human environment, microbial population, and con
22、duct the complex microorganism group structure succession rule research, as well as biological populations dynamic analysis. Especially in the last few years, the domestic and foreign scholars use different molecular biology methods to conduct the research on bacterium 16S rRNA, which already obtain
23、ed widespread 16SrRNA sequence database, and made the foundation for us to compare the micro ecology research.At present rats and mice are mainly used for the study of the intestinal microflora, and their advantages are small size, easy operateing, fast reproduceing. cheapping, etc. But there are ma
24、ny differences between the rodents and human beings in anatomy, physiology and metabolism. So they are not the good model animals for intestinal tract micro ecology research. However, miniature pigs, on the physiology, anatomy and nutrient metabolism are more similar with human, and some human disea
25、ses such as cirrhosis, diabetes, hypertension and some nutritional and metabolic disorders are possible to occur in miniature pig. Currently more and more papers take miniature pigs as experimental material. This thesis studied commonly used laboratory animals mouse (FVB/n and BALB/c), rats (SD and
26、Wister), miniature pigs (Bama miniature pig and Guizhou miniature pig) and human fecal sample by using PCR-DGGE technique to compare the diversity of the microbiota.The diversity, richness and evenness of intestinal flora were analyzed and the similarity of UPGMA cluster analysis results were compar
27、ed to reflect the features of intestinal flora of these commonly used laboratory animals and to further provide some basic data for intestinal microflora study.Purposes and significanceBy using the comparative micro-ecological approaches, the thesis clarified tlie commonly used experimental animal i
28、ncluding mice, rats and miniature pigs indirectly and directly to compare with the gut flora of human beings, and correctly reflecting the #Abstractintestinal floras differences and similarities among human being and those animals.From our work, characteristics of microflora of those commonly used l
29、aboratory animals were partly revealed and the advantages of them in applying to the microrcology research were presented.Methods1. Collect healthy adult mice (FVB/n and BALB/c), rats (SD and Wister), miniature pigs (Bama miniatuure pig and Guizhou miniature pig) and human fecal samples to extract t
30、otal bacterial DNA;2. Respectively use V3 (total bacteria) primer, Lac (Lactobacillus) primer, Bfr (Bacteroides) primer to amplify the extracted DNA;3. Denature the gradient gel electrophoresis (DGGE);4. On each band on gel electrophoresis, use spssl3.0 analysis software for data analysis.ResultsBy
31、analyzing the diversity, richness and evenness of intra-and inter-specific of total intestinal bacteria, Lactobacillus and Bacteroides genus by using PCR-DEEG method, no significant differences were found between the genuses of each kind of animals (p0.05) but obvious distinction were observed in va
32、rious species(p0.05),The results from UPGAMA dusting showed that the miniature pig was more highly similar with human beings in intestinal tract bacteria comparing with the mice or rats.Key words: Experimental animals, intestinal flora, diversity. PCR-DGGE西南大学硕七学位论文第1章文献综述动物肠道菌群的研究方法与研究现状1前言人类是由10%的
33、人体细胞和90%的微生物细胞共同组成的“超级生物体” I 肠道微生物是人和动物体重要组成部分，肠道微生物组是人和动物体最庞大而复 杂的微生物群落，肠道中栖息着大约10M个，1000多种微生物，按重量计算，人 体携带的微生物总重量约为1500g2000g,相当于人肝脏重量2,其总数相当于人 体细胞总数量的10倍，基因数量更是比人类基因多百倍以上，从生长、发育、消 化、营养吸收、能量供应、脂肪代谢、免疫调节、药物代谢和毒性等诸多方面影 响人和动物的健康状况39人的胃肠道菌群在人的生命活动中起着非常重要的作 用，肠道微生态结构主要由厌氧菌、兼性厌氧菌和好氧菌组成，主要分布在结肠 部位，胃肠道其他节段
34、细菌的种类和数量则较少，在正常情况下，保持着相对的 平衡和稳定。其中专性厌氧菌占99%以上L作为主要的原籍筐定植在肠道黏膜上, 借助固有的肠道黏膜屏障和肠道内的杀菌物质及宿主自身免疫系统，防止外籍菌 的粘附和定植，协同作用，共同维持肠道内微生态的平衡。病理情况下，肠道菌 群与宿主的共生状态出现异常，有益菌减少，有害菌大量增殖，导致肠道微生态 平衡失调，从而影响宿主健康，甚至危及生命。因此，对肠道微生态进行更加深 入的研究有着重要的价值。对于肠道微生态的研究，传统的方法是通过微生物的选择性培养，或者是通 过直接形态观察来获得部分信息，再进行鉴定和分类。局限性在于传统培养方法 费时费力，易受操作方
35、法的影响，敏感度低；在现有技术条件下能够通过培养分 离的微生物只占细菌总数的0.1%7%左右8,只能定性检测可培养的细菌，不能鉴 定未知的细菌，故不能正确的反映肠道菌群的数量和多样性，不能全面了解肠道 微生物之M和与宿主的相互关系阻碍了人类对肠道微生物的认识9。近年来，随着 分子生物学技术的迅猛发展，分子生物学技术在微生态学中的应用也日益广泛， 能快速获得微生物种群定性、定量数据，这使得微生态学现有的研究范围得以进 一步扩展。如运用16S rRNA基因DGGE （变形梯度凝胶电泳，Denaturing gradient gel elecctrophoresis）图谱技术对两个新生儿肠道菌群多样
36、性进行了连续分析，对 人类自出生之日起肠道微生态系统的发生发展进行了动态检测2运用FISH技术 进行大规模的肠道微生物的人群流行病学调查研究等等。研究肠道微生态过程 中通过分子生物学技术，越来越多的尚未能培养的微生物被发现，粪便DNA分析 技术已成为微生态学的一个研究热点。2肠道微生物的功能随着研究技术的进展和对肠道微生态重视程度的增加，人们越来越多的了解 肠道微生态菌落，肠道正常的微生物群落是微生物与宿主在共同进化过程中形成 的，数量巨大，对宿主有益而且必要，研究表明其与宿主的营养、代谢、免疫、 毒性等诸多方面紧密相关56%是人体的一个重要的“器官”巴2.1 肠道微生物与菅养肠道微生物对宿主
37、的一个重要功能就是营养功能70肠道微生物能够促进肠道 组织发育，肠道细菌代谢产生的短链脂肪酸（SCFA）对于宿主的生理有很重要的 影响，其中一个重要作用就是为肠道上皮细胞提供营养，促进上皮细胞生长与分 化。肠道内的一些正常微生物，如梭菌、双歧杆菌、乳杆菌等能合成多种蛋白质 和维生素，供宿主利用，同时肠道微生物能够结合氨基酸分解的N%,重新合成蛋 白质或其他人体必需氨基酸，此外，肠道微生物还能够促进宿主对亚油酸的吸收, 促进胆固醉向类固醉方向的转变味改善纸质代谢紊乱的作用等等!一些相关性 研究资料也表明肠道菌群多种离子（如，钙，铁，镁，锌）的吸收J2.2 肠道微生物与代谢肠道菌群的基因多样性，拥
38、有人类和其他哺乳动物未能进化产生，为微生物 系统所独有的.这些基因产物为人类和哺乳动物的某些代谢过程提供了各种能和 生化代谢途径。通过发酵和降解多糖（如淀粉，纤维素，半纤维素，胶质等），以 及不能被宿主吸收的寡糖来产生能量，代谢终产物为一些短链脂肪酸8。短链脂 肪酸如乙酸、丙酸、丁酸等不仅为微生物自身的生长和增值提供能量和营养物质, 而且是宿主能利用的能量和生化反应的底物,9o肠道微生物基因组中富含参与糖 类、氨基酸、外来化合物代谢、甲烷产生、维生素和胆固醉代谢的基因2力，同时 肠道微生物还参与了胆汁酸、脂类的代谢过程巴也能促进宿主对单糖和SCFA的 吸收和甘油三函的合成，说明了肠道微生物也是
39、人体多种代谢的重要参与者。23肠道微生物与免疫肠道微生物具有抵御病原微生物侵袭、刺激机体免疫器官的成熟、激活免疫 系统等作用，随着人和动物生长发育到不同阶段，胃肠道微生物菌群也随之在种 类和数量上变化，不同种类和数量的正常微生物定植在胃肠道黏膜以及分布在肠 道内容物中，形成动态微生态平衡，肠道还是人体内最大的淋巴器官，肠道内的 淋巴组织含有名主全部免疫能力的重要成分。由于肠道细胞直接与肠道共生菌及 外来锅炉菌相接触，能有效阻止致病菌和病毒等外籍微生物的入侵和繁殖，因此 第1章文献综述说肠道微生物成为宿主的免疫屏障的重要组成部分。肠道菌群不仅对肠道黏膜免 疫系统的发育和激活有重要作用同样，正常的
40、胃肠道微生物群落能刺激宿主建立 完备的免疫系统，对肠道外全身免疫系统也有重要作用。已有研究发现普通小鼠 相对于无菌小鼠和悉生小鼠，脂多糖刺激脾脏来源地巨噬细胞产生IL-12的作用明 显增强，提示完整的肠道菌群是脾脏产生IL12的基础23。此外，宿主免疫系统还 受到肠道细菌与宿主之间的相互作用的影响。同时，宿主的防御系统会适应和控 制细菌的生长。3肠道微生态研究现状、方法及近些年研究技术进展一直以来，肠道微生物多样性研究依赖于选择性培养技术，但由于肠道内多 为专性厌氧菌，且可培养分离鉴定的细菌只占总数的很小一部分，绝大多数肠道 微生物都难以通过培养分离或是目前技术水平还不能对其培养的微生物，与宿
41、主 的关系我们也知之甚少。随着分子生物学技术的发展和研究的深入，我们对肠道 微生物有了更进一步的认识和了解，同时也对尚不能培养的微生物的多样性及功 能研究有了许多发现，而随着代谢组学技术的发展，特别是其与分子生物学技术 的结合，克服了在检测前必须培养菌体的问题，为研究不可培养微生物提供了可 能性，为肠道微生物的功能研究开辟新的更加宽广的领域。3.1 基于16SrRNA基因的分子生态学技术由于大多数微生物很难或在现有的技术条件下不能分离鉴定，因此分子生物 学技术因为其快速、动态监测并可以同时比较不同个体、不同环境的微生物群落 结构变化等的优越性在肠道微生态研究中得到了广泛的应用。16S rDNA
42、是编码 16S rRNA的基因组DNA,是目前微生物生杰学研究中已经广泛使用的“生物标记 (biomarker),近年来基于16S rRNA的分子生物学技术有：PCR变形梯度凝胶 电泳(DGGE)：实时荧光定量PCR(Real-time PCR)；随机扩增多态性技术(RAPD)； 限制性片段长度多态性分析法(RFLP)；核酸杂交/基因芯片；细菌16SrRNA克隆 及序列分析等。3.2 元基因组技术元基因组是指自然环境中全部微生物的基因组，包含了可培养和未培养的微 生物基因组2、元基因组学技术利用高通量、大规模测序，结合生物信息学工具， 能够发现大量过去无法得到的微生物新基因或新的基因簇，可以直
43、接获得反映肠 道微生物功能的基因组信息，为人们研究肠道微生物与宿主的健康和疾病的发生、 发展的关系，以及了解肠道微生物区系组成、进化历程和代速特点提供了新的技西南上学硕士学俏论文术平台。3.2.1 元基因组学研究方法元基因组的研究程序包括从环境样品中直接提取DNA/RNA,将得到的 DNA/RNA克隆到适合的载体（噬菌体、Fosmid、BAC等），再将载体转化到宿主 菌（大肠杆菌）建立元基因文库，对文库进行功能和序列驱动筛选，结合生物信 息学工具，最终得到生物活性物质或微生物遗传信息.3.2.1.1 功能驱动筛选法功能驱动筛选法是利用选择性培养基，筛选能分解底物的目标克隆，鉴定其 生化和分子生
44、物学特征，具有快速、简单的特点，已广泛用于医药、农业和工业 中活性物质的笳选。3.2.1.2 序列驱动动荡筛选法序列驱动筛选能鉴定酶的可能代替物，其依赖于保守序列探针或PCR引物以 .及生物信息学的发展，Liles等利用16S rRNA探针筛选元基因组文库，从中鉴定 了大量未培养的耐酸性细菌，并对其全长测序25。MEGAN软件是目前分析元基因 组数据的有效工具，利用直接比对序列与NCBI分类数据库比对，能对序列进行系 统分类。3.2.13样品富集技术在元基因组学分析中，靶基因可能只占环境总基因的很小一部分，因此，利 用富集的方法能够有效提高筛选效率。通常离心是富集的有效方法，还可以根据 微生物
45、生理生化特点，利用选择性培养基对样品进行富集培养。Kruge产等利用N 标记氨作为氮源培养甲烷氧化厌氧微生物检测淤泥中慢生型微生物的生长。Rees” 等利用陵甲基纤维素培养基富集培养微生物最终得到了 4倍量的纤维素酶基因。3.2.1.4基因富集技术基因富集能获得大量高纯度DNA,有助于研究特殊微生物群体。稳定同位素 探针技术（SIP）被广泛应用于研究参与特殊物质代谢的个别群体，该技术利用寒 稳定同位素的底物培养微生物，通过杂交方法鉴定参与标记底物代谢的微生物种 群。Urbach等利用13C标记酚富集厌氧菌群后利用RNA-SIP分析，最终证明了 Thaurea是降解酚的主要细菌”基因差异表达技术
46、可用于特殊基因的选择性富集, 可比较样品中基因在底物中培养前后的表达状况，已被用于鉴定食草动物肠道菌 群随F1粮改变的适应性变化状况加。#西南大学硕士学位论文3.2.2元基因芯片技术肠道菌群的组成不仅庞杂，而且存在个体差异，与宿主的多种因素如性别、 年龄、饮食结构、生活环境和健康程度密切相关。因此，迫切需要进行对人群的 流行病学研究，基因芯片技术能够高效、快速、地检测肠道雷群结构的改变。减 少了传统PCR扩增中可能出现的偏移和误差,并能够节省大量的试剂和仪器损耗， 被认为是研究为生态群落结构，病原菌流行病学调查，监测不同状态下宿主肠道 微生态结构的一种重要方法。3.3代谢组学技术人体产生的代谢
47、产物分两类，一类是由人体本身细胞代谢产生的，另一类是 由人体和微生物共同代谢产生的。例如血液和尿液样本主要反映宿主的代谢，粪 液主要反映了肠道微生态菌群的代谢。代谢组学（metabonomics）是20世纪90 年代中期继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后发展起的，是研究代谢组在新 陈代谢某一时刻的变化规律的一门学科3,代谢组学作为一门新发展的技术，它是 通过考察生物体系受刺激或扰动后其代谢产物的变化或随时间动态的变化，来研 究生物体系的代谢途径，利用高通量、高灵敏度和高精度的现代分析技术，对细 胞、有机体分泌出来的代谢物的整体组成进行动态跟踪分析，利用多变量统计（归 一化与滤燥、非监督学习方
48、法、有监督学习方法等），来解析被研究对象的生理、 病理状态下及其与外界环境因子、基因组成等的关系31。4肠道菌群与人体健康和疾病在正常情况下，肠道微生物菌群与人体和外界环境保持着一个动态的平衡状 态，肠道微生物通过肠肝循环对人体的健康状况起着重要作用，但是这种平衡在 某些情况下（如病态、水土不服等），可被打破，形成肠道菌群紊乱，表现为肠道 菌群在种类、数量、比例、定位和生物学特性上的变化。4.1 与人类共生的肠道菌群健康个体肠道中拥有上千种微生物，其中99%的微生物仅由30yo个种属的 细菌构成，主要为：拟杆菌属、双歧杆菌属、梭菌属、肠道球菌、真杆菌、消化 锥球菌属、乳酸菌及埃希杆菌属等。每种细菌尽管只有简单的代谢功能，但是种 属之间能够协同作用，为彼此和宿主提供营养物质。正常肠道菌群外源性治病微
