1、第18章高效液相色谱法igh performance liquid chromatography; HPLC(1)Introduction。高效液相色请法的主要类型和原理o高效液相色指沫的固定相和流动相及其选择。高效液相色滑仪。高效液相色指分析方法7HPLC以高压输送流动相,采用高效固定相及高灵敏度检测器,发展而成的现代液相色增分析方法与经臭液相色if法相比。应用颗粒细、规则均匀的固定相,传质阻抗 小,柱效高,分离效率高。流速怏,分析速度怏。使用高灵敏度检测器,大大提高了灵敏度与气相色谱法相比。不受试样的挥发性和热稳定性的限制,应用 范围广。可选用不同性质的各种溶剂作为流动相,分 离选择性高。
2、一般在室温条件下进行分离,不需要高柱%IIIWaters2690岛津高效液相色谱仪LC-10A系列Waters LC-600一、高效液相色谱法的主要类型和原理1 .高效液相色超法的主要类型。按固定相的聚集状态分类液液色谓法(LLC )液固色谓法(LSC)。接分离机制分类分配色谱法(partition chromatography )吸附色塔法(adsorption chromatography )离子交换色请法(ion exchange chromatography; IEC )分子排阻色酒(molecular exclusion chromatography; MEC)按分离机制分类(练)亲
3、和色漕法(affinity chromatography; AC )手性色谱法(chiral chromatography; CC )胺束色谱法(micellar chromatography; MC ) 电色谱法(electro chromatography; EC )最常见的HPLC化学键合相色谓法(bonded phase chromatography;BPC)离子抑制色漕法(ion supression chromatography; ISC ) 离子对色 i普法(paired ion chromatography; PIC or IPC )132 ,化学键合相色措法bonded ph
4、ase chromatography (BPC)化学健合相:通过化学反应招有机基团键台在载体表面构成的固定相。化学鲤合相色谱法:以化学键合相为固定相的色漕法。15固定相:氟基化学键合相:与世胺相似氨基化学键合相:分析糖类流动相:非极性或弱极性溶剂。正己烷,氯彷等。极性:固定相流动相 主要用于分离溶于有机溶剂的极性至中等极性的分15子型化合物分离机制:分配过程吸附过程(诱导、氢键和定向作用等)组分的出峰II序:极性小的先出峰,极性大的后出峰。ill(2)反相键合相色谓法reversed phase-bonded phase chromatography 流动相的极性与容量因子的关系:流动相的极性
5、3洗脱能力T ,溶质的41,东I固定相:十八烷基键合相(&8或0DS) 流而相:甲醺-水或乙庸-水极性:固定相流动相分离机制:复杂组分的出峰顺序:极性大的先出峰,极性小的后出峰。#a.疏溶剂理给 solvophobic theory当非极性溶质或溶质分子中的非极性部分与极性 溶剂相接触时,相互产生斥力,溶质分子中非极 性部分的取向导致极性溶剂中形成一个“空腔”, 即疏溶剂作用。口溶质分子的非极性部分与固定相上的煌基间产生疏溶剂缔合溶质的极性部分受到极性流动相的解缔合作用,使它离开煌基b.保留行为的主要影喟因素口溶质的分子结构溶质的极性越弱,其疏水性越强,k越大,tR也越大;同系物中,成数越多,
6、kit口流动相 流动相的极性增大,洗脱能力降低;有机溶剂含量增 加,k值变小 流动相的PH变化会改变溶质的离解程度,离解程度越 高,k值越小 流动相中加入中性盐,表面张力变大,使中性洛质他k 增大例:固定相:Cl8流动相:甲醇:水某组分的2h=20min ,(20:80)如何使市减小?21离子抑制色谱法(ion suppression chromatography; ISC)通过调节流动相的pH,抑制有机弱酸、弱碱的离解,增加 它与固定相的疏水缔合作用,以达到分离的色谱法 样品为弱酸,降低流动相的pH, k增大,1增大; 样品为弱碱,提高流动相的pH, k增大,tR增大; 注意流动相的pH值不
7、能超过键合相的允许范围口固定相碳链越长,疏水性越强,k增大 链长一定时,硅胶表面键合烷基的浓度越大,k越大 键台基团的链长和浓度还最响分离的选择性应用:非极性及中等极性的分子型物质。反相离子对色谱法paired ion chromatography, PIC ion pair chromatography, IPC定义:离子对试剂加入极性流动相中,样品离子与反离子生成中性离子对,使样品的K增虬改善分离效果。a.离子对试剂:阴离子分离:酸类或带负电荷的物质,常采用烷基簌类,如氢氧化四丁基银或氢氧化十六烷基 三甲钱作为对离子;阳离子分离:碱类或带正电荷的物质,常采用烷基磺酸类,如己烷演的的作为对离
8、子;25B + H-RSO3Na(PICB)b.分离机制:流动相(m)u BH+ +n RSCV+Na+BH+ - RSO3- 中性离子对固定相(s)之BH+ RSO3-J#c.一喟保留因子的因素:离子对试剂的种类和浓度离子对试剂碳链长度增加,组分的k增大,tR增大离子对试剂浓度较低时,试剂浓度升高,k增大,然后趋于稳 aE采用长链离子对试剂时,当离子对试剂浓度超过一定值时,试 剂浓度升高,k减小口流动相流动相极性增大,组分的k僧大,tR增大试样组分与离子对试剂全部离子化时,组分的k值最d.优缺点与用途:优点:易实现:ODS柱,甲醺-水,离子对试剂。可避免缓冲液对流路的腐蚀(IEC)缺点:PI
9、C试剂价格贵。用途:生物碱、有机酸、磺胺类药物等。293.其它高效液相色请沫(1)离子色增法ion chromatography离子色惜是在20世纪70年代中期发展起来的一种技术,其与离子交换色惜的区别是其采用了特制的、具有极低交换 容量的离子交换树脂作为柱填料,并采用淋洗液抑制技术和 电导检测器,是测定混合阴离子的有效方法。抑制型(双柱型)离子色措法非抑制型(单柱型)离子色谱法29方法原理分离柱,交换反应:R+ -OH- + NaXR+ -X + NaOH olio 洗脱反应:R+X+NaOH fR+OH- +NaX抑制柱:与组分反应:R H+ + NaX -R- Na+ + HX高交换容量
10、的l、斗明如匕上 用离子交换剂与洗脱剂反应:R H+ + NaOH f R一 Na+ + H2O(2)手性色请法:chiral chromatography, CC手性固定相流动相中加入手性流加剂用途:分离、分析立体异构体31载化的配基将亲和色谱法示意图二二匚二二 S 一二二一二二三二二二二二二二口二体(3)亲和色谱(AC) Affinity chromatography原理:利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力,进行选择性分离。先在载体表面键合上一 种具有一般反应性能的所 谓间隔臂(环氧、联胺等), 再连接上配基(。、抗原等)能和具有亲和力特性吸附 的生大分子作用而被保 留。改变
11、淋洗液后洗脱。(4)排阻包增size- exclusion chromatography固定相:凝胺(具有一定大小孔隙分布);原理:技分子大小分离。 小分子可以r散到趣胶空隙, 由其中通过,出峰最慢;中等 分子只能通过部分源腋空隙, 中速通过;而大分子被排斥在 外,出峰最快;溶剂分子小, 放在最后出峰。全部在死体积前出峰;可对相对分子质量在100- 1伊范围内的化合物按质量分离HPLC的固定相和流动相及其选择#1.化学键合固定相:目前应用最广、性能最佳的定相;4硅氧碳键型:三Si0一Cb,硅氧硅碳键型:三Si0Si C稳定,耐水、耐光、耐有机溶剂,应用最广;c,硅碳键型:=SiCd .硅氮铤型
12、:三SiN键合相的种类。非极性键合相表面为非极性基团,C18, C8, C1,未基等;通常用于反相色措。弱极性键合固定相 酗基和二校基键合相; 可作为正相或反相色惜固定相,应用较少。极性键合相 氨基、氨基基合相 通常用于正相色措键合相的性质和特点a.键合反应b.含碳量和覆盖度存在着双重分离机制:(键合基团的覆盖率决定分离机理) 高覆盖率:分配为主;低覆盖率:吸附为主;一39C,化学健合固定相的特点(1)传质怏,表面无深四路,比一般液体固定相传质快;(2)寿命长,化学键合,无固定液流失,耐流动相冲击;耐水、耐光、耐有机溶剂,稳定;(4)选择性好,可键合不同官能团,提高选择性;(5)有利于梯度洗脱;