1、第十四章,DNA的生物合成 DNA Biosynthesis ( Replication ),本章主要内容：,DNA复制的基本特征 DNA复制的酶学和拓扑学变化 原核生物DNA复制过程 真核生物DNA生物合成过程 逆转录,本章重点,一、复制的基本特征（掌握概念与特点） 二、DNA复制的酶学（掌握原核生物的酶及功 能, 熟悉真核生物） 三、复制过程（熟悉原核生物大致的复制过程） 四、逆转录（掌握概念, 熟悉酶及作用）,复制(replication) 是以DNA为模板的DNA合成，是基因组的复制过程。,DNA复制的基本特征 Basic Rules of DNA Replication,第 一 节,
2、半保留复制(semi-conservative replication) 双向复制(bidirectional replication) 半不连续复制(semi-discontinuous replication),DNA复制的主要特征,一、 DNA以半保留方式进行复制,子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。,半保留复制:,A G G T A C T G C C A C T G G,T C C A T G A C G G T G A C C,C C A C T G G,G G T G A C C,A G G T
3、A C T G,T C C A T G A C,T C C A T G A C,A G G T A C T G,A G G T A C T G C C A C T G G,T C C A T G A C G G T G A C C,A G G T A C T G C C A C T G G,T C C A T G A C G G T G A C C,+,母链DNA,复制过程中形成的复制叉,子代DNA,子链继承母链遗传信息的几种可能方式:,全保留式 半保留式 混合式,密度梯度实验:,实验结果支持半保留复制的设想。,含15N-DNA的细菌,第一代,第二代,梯度离心结果,子代保留了亲代的全部遗传信息
4、，体现了遗传的保守性。,半保留复制的意义:,遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。,原核生物基因组是环状DNA，只有一个复制起点（origin）。复制从起点开始，向两个方向进行解链，进行的是单点起始双向复制。,二、DNA复制从起点向两个方向延伸,A. 环状双链DNA及复制起始点 B. 复制中的两个复制叉 C. 复制接近终止点(termination, ter),真核生物每个染色体有多个起始点。,复制子(replicon)： 两个相邻起始点之间的距离。 复制子是独立完成复制的功能单位。,三、DNA复制反应呈半不连续特征,领头链 (leading strand),后随链 (laggi
5、ng strand),领头链(leading strand)：顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的。 后随链(lagging strand)：复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，不连续复制的链。复制中的不连续片段称为岡崎片段(okazaki fragment)。,DNA复制的酶学和拓扑学变化,第 二 节,The Enzymology and Topology of DNA Replication,参与DNA复制的物质:,底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP； 聚合酶(polymerase): 依赖DNA的DNA聚合酶，简写为 DNA-p
6、ol； 模板(template): 解开成单链的DNA母链； 引物(primer): 提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合； 其他的酶和蛋白质因子。,(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi,RNA引物,RNA引物,子代DNA,聚合反应的特点:,DNA新链生成需RNA引物和模板； 新链的延长只可沿5 3方向进行。,一、DNA聚合酶,全称：依赖DNA的DNA聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase) 简称：DNA-pol,活性：,1. 53 的聚合活性 2. 核酸外切酶活性,作用：,催化磷酸二酯键形成 新的DNA链合成,3 5外切酶活性:,5 3外
7、切酶活性:,?,能切除引物，突变的 DNA片段。,能辨认错配的碱基对，并将其水解。,核酸外切酶活性:,（一）原核生物有3种DNA聚合酶,DNA-pol DNA-pol DNA-pol ,27,Klenow为DNA pol水解大片段，常用的工具酶,原核生物的DNA聚合酶,（二）常见的真核细胞DNA聚合酶有5种,DNA-pol ,起始引发，有引物酶活性。,延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。,参与低保真度的复制 。,在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。,在线粒体DNA复制中起催化作用。,DNA-pol ,DNA-pol ,DNA-pol ,DNA-pol ,真核生物的DNA聚合酶,（三）复制保
8、真性的依据,半保留复制； 遵守严格的碱基配对规律； 聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能； 复制出错时有即时校对功能。,A.依赖模板,选择正确碱基, B.配对错误碱基不易形成氢键,不能形成磷酸二酯键。,A：切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。 B：碱基配对正确， DNA-pol不表现活性。,DNA pol 的校读功能,(二) 解螺旋酶（DnaB）,作用：解开DNA双链(耗能),DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。,（三）DNA拓扑异构酶,复制时DNA局部解链，导致其余部分拧得更紧，成为正超螺旋，阻碍双链的继续解开。,解链过程中正超螺旋的形成,既能水
9、解 、又能连接磷酸二酯键。,拓扑异构酶 拓扑异构酶,拓扑异构酶分类：,拓扑异构酶作用特点：,拓扑异构酶,切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。 反应不需ATP。,拓扑异构酶,切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。 利用ATP供能，连接断端， DNA分子进入负超螺旋状态。,作用机制：,（四）单链DNA结合蛋白（SSB）,功能：）与单链DNA结合，维持模板处于单 链状态; ）防止单链被核酸酶降解。,（五）引物酶（DnaG）,特点： 是一种特殊的RNA聚合酶， dnaG基因的产物。 作用： 催化引物RNA片段, 提供3 OH（与解旋酶共
10、同作用）,连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。,DNA连接酶(DNA ligase)作用方式：,（六）DNA连接酶,HO,5,3,3,5,DNA连接酶,ATP,ADP,5,3,5,3,DNA连接酶的作用：,DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。 在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。 也是基因工程的重要工具酶之一。,功能：,DNA聚合酶，拓扑酶和连接酶催化3,5-磷酸二酯键生成的比较,原核生物DNA复制过程 The Process of DNA Replication in Prokaryotes,第 三
11、 节,需要解决两个问题：,1. DNA解开成单链，提供模板。,2. 形成引发体，合成引物，提供3-OH末端。,一、复制的起始,E.coli复制起始点 oriC,（一） DNA的解链,原核生物的复制起始部位及解链,Dna A,Dna B、 Dna C,DNA拓扑异构酶,引物酶,SSB,3,5,3,5,（二）引物合成和引发体形成,含有解螺旋酶B、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。,3,5,3,5,引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。,引物,引物酶,二、DNA链的延长,复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质
12、是磷酸二酯键的不断生成。,OH 3,3,领头链的合成：,领头链的子链沿着53方向可以连续地延长。,后随链的合成,在复制叉同时合成前导链和后随链,原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。,三、复制的终止,子链中的RNA引物被取代,真核生物DNA生物合成过程 The Process of DNA Biosynthesis in eukaryotes,第 四 节,真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。 复制的起始需要DNA-pol （引物酶活性）和pol （解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子(re
13、plication factor, RF)。,一、真核生物复制的起始与原核基本相似,增殖细胞核抗原（proliferation cell nuclear antigen，PCNA）在复制起始和延长中起关键作用。,DNA-pol -合成引物 PCNA的协同作用 DNA-pol 逐步取代pol 连续合成领头链。随从链,二、真核生物复制的延长发生DNA聚合酶/转换,3,5,5,3,领头链,3,5,3,5,亲代DNA,后随链,引物,核小体,三、真核生物DNA合成后立即组装成核小体,5,3,3,5,5,3,3,5,+,5,3,3,3,3,5,5,四、复制的终止与端粒酶,真核细胞染色体线性DNA分子末端的
14、特殊结 构，是由端粒DNA和与端粒结合蛋白组成的 核糖核酸的蛋白质复合物。,端粒(telomere),功能： 维持染色体的稳定性 维持DNA复制的完整性,端粒酶(telomerase),端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR) 端粒酶协同蛋白(human telomerase associated protein 1, hTP1) 端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTRT),组成：,端粒酶催化作用的爬行模型,65,端粒酶的作用, 端粒酶RNA互补结 合母链，并移至其3-OH末端； 以端粒酶RNA为模板，
15、母链3末端提供 3-OH，通过端粒酶逆转录酶延长母链。 延长的母链反折，DNA-pol接替完成双链复制。,真核所有染色体DNA复制仅仅出现在细胞周期的S期，而且只能复制一次。,五、真核生物染色体DNA在每个细胞周期中只能复制一次,逆转录和其他复制方式 Reverse Transcription & Other DNA Replication Ways,第五节,逆转录 (reverse transcription) 以病毒RNA作模板，dNTP为底物，色氨酸tRNA 或脯氨酸tRNA为引物，在逆转录酶(reverse transcriptase)催化下合成DNA链的过程。,逆转录病毒细胞内的逆转
16、录现象:,模板：病毒RNA 引物：病毒的一种tRNA 逆转录酶：1.依赖RNA的DNA聚合酶 2.RNaseH 3.依赖DNA的DNA聚合酶 底物：dNTP 合成方向：5 3 产物：DNA,逆转录的条件,分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为cDNA法。,以mRNA为模板，经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链。,试管内合成cDNA:,二、逆转录的发现发展了中心法则,逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。 逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能。 对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论。,D环复制(D-loop replication),是线粒体DNA (mitochondrial DNA，mtDNA)的复制形式。,三、真核生物线粒体DNA按D环方式复制,
