1、第3课时导入、检测和鉴定目的基因,第一章第一节基因工程概述,学习导航 1.理解目的基因导入受体细胞的方法。 2.掌握检测与鉴定目的基因的方法。 重难点击 1.目的基因导入受体细胞的方法。 2.检测和鉴定目的基因的方法。,课堂导入 方式一通过前面的学习，我们了解了基因工程中目的基因的获取及基因表达载体的构建。 在目的基因与载体连接成重组DNA分子以后，下面的重要工作主要是将其导入受体细胞进行扩增和筛选，获得大量的重组DNA分子，这就是外源基因的无性繁殖，即克隆(cloning)。 由于外源基因与载体构成的重组DNA分子性质不同、宿主细胞不同，将重组DNA导入宿主细胞的具体方法也不相同。,方式二目
2、的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测和鉴定才能知道。这是基因工程的第四步工作。以上步骤完成后，在全部的受体细胞中，真正能够摄入重组DNA分子的受体细胞是很少的。因此，必须通过一定的手段对受体细胞中是否导入了目的基因进行检测。检测的方法有很多种，例如，大肠杆菌的某种质粒具有青霉素抗性基因，当这种质粒与外源DNA组合在一起形成重组质粒，并被转入受体细胞后，就可以根据受体细胞是否具有青霉素抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因。重组DNA分子进入受体细胞后，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达过程。,一、导入目的基因,内容索引,当堂检测,二、检测和鉴
3、定目的基因,一、导入目的基因,(一）方法： 1.将目的基因导入植物细胞,（1）农杆菌转化法,特点:易感染双子叶植物和祼子植物,对单子叶植物无感染能力,原理:Ti质粒的TDNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上,过程:,植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。,（3）花粉通道法,（2）基因枪法,基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。,2.将目的基因导入动物细
4、胞 方法：显微注射法 过程：,3.将目的基因导入微生物细胞 原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少 方法：Ca2+处理法增加细胞膜对DNA的通透性。（感受态细胞，在一定的温度下促进其吸收重组DNA分子）。 过程：,问题探究,1.农杆菌转化法的分析 (1)将基因表达载体导入农杆菌细胞时，应怎样处理农杆菌细胞？,答案,答案基因表达载体(重组质粒)导入农杆菌细胞时，要用Ca2处理农杆菌细胞，使其处于感受态，利于重组质粒的导入。,(2)在用土壤农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中，为什么一定要将目的基因插入到Ti质粒的TDNA上？,答案,答案农杆菌中的Ti质粒上的TDNA(可转移的DNA)可转
5、移至受体细胞，并且整合到受体细胞的染色体DNA上。,农杆菌转化法中两次拼接、两次导入的辨析 第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的TDNA的中间部位，第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的TDNA拼接到受体细胞染色体的DNA上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的TDNA导入受体细胞。,2.植物基因工程常用的受体细胞为什么可以是体细胞，而动物基因工程一般只用受精卵？ 3.为什么微生物细胞适合作为基因工程的受体细胞？,答案,答案植物体细胞的全能性较高，可经植物组织培养过程形成完整植物体，因此受体细胞可以是体细胞；动物体细胞的全能性受到严格
6、限制，因此动物基因工程中的受体细胞一般只用受精卵。,答案微生物细胞具有繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少的优点。,拓展应用,1.农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染植物，因而在植物基因工程中得到了广泛的运用。如图为农杆菌转化法的示意图，试回答下列问题：,解析一般农杆菌不能感染的植物是单子叶植物，可感染双子叶植物和裸子植物。利用其感染性，可实现目的基因导入植物细胞。真正可转移至受体细胞并整合到受体细胞染色体的DNA上的是农杆菌TDNA片段，因此目的基因必须插入到该部位才能成功。,(1)一般情况下农杆菌不能感染的植物是_，利用农杆菌自然条件下感染植物的特点，能实现_。具体原理是在
7、农杆菌的Ti质粒上存在TDNA 片段，它具有可转移至受体细胞 并整合到受体细胞_ 上的特点，因此只要将携带外源 基因的DNA片段插入到_(部位)即可。,答案,解析,单子叶植物,将目的基因导入植物细胞,染色体的DNA,TDNA片段(内部),解析根据TDNA这一转移特点，可以推测该DNA片段能控制合成DNA连接酶、限制酶以实现与双子叶植物细胞染色体DNA的整合。,(2)根据TDNA这一转移特点，推测该DNA片段上可能含有控制_ _酶合成的基因。,答案,解析,DNA连,接酶、限制,（二）利用标记基因筛选导入重组质粒的受体细胞-插入灭活法,【2019年江苏高考33题（改编）】下图是某基因工程中构建重组
8、质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因（tetr)和氨苄青霉素抗性基因（ampr）。,添加氨苄青霉素的培养基,平板影印培养法,筛选含有质粒和重组质粒的受体细胞,筛选含有重组质粒的受体细胞,导入重组质粒的受体细胞特点是： 。,抗氨苄青霉素但不抗四环素,(1) 为了避免目的基因和质粒在酶切后产生的片段发生自身环化或任意连接，以及便于筛选需要，在实际操作中，一般应选用_ _(填限制酶名称)同时酶切质粒和含目的基因的外源DNA。再用 酶处理。 (2) 为了筛选获得含有重组质粒的大肠杆菌，实验人员首先将经转化处理过的大肠杆菌接种在含_(抗生素)的培养基中，然后用影印法将该培养基上的菌落按原来的
9、方向印在含_(抗生素)培养基上，以筛选获得含重组质粒的细菌。,【例题】下图甲表示某细菌的质粒中相关限制酶的切割位点，图乙表示目的基因所在的DNA中相关限制酶的切割位点。请分析并回答下列问题：,Pst和Hind酶,DNA连接,四环素,氯霉素,二、检测和鉴定目的基因,目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测和鉴定才能知道。,基础梳理,1.DNA水平检测：采用 。主要做法是用 标 记的已知DNA片段作 检测受体细胞。如果能发生特异性结合，说明目的基因已经插入转基因生物 中。,放射性同位素,DNA分子杂交法,基因探针,染色体的DNA,2.RNA水平检测：采用 技术。用已标
10、记的 作为探针与待测生物体内提取的 分子杂交，观察是否出现杂交带。 3.蛋白质水平检测：采用 法。从待测转基因生物中提取 ， 用相应的 进行杂交，若有杂交带出现，表明目的基因已经表达了。 4.个体水平检测：对个体的 进行检测。,目的基因,分子杂交,mRNA,抗原抗体杂交,蛋白质,抗体,生物学特定性状,问题探究,1.观察目的基因的检测示意图(如下图所示)，回答下列问题： (1)检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，采用DNA分子杂交技术。这种技术的主要做法是什么？,答案主要做法是用标记了放射性同位素的目的DNA片段作为探针，检测受体细胞的DNA中有无目的基因。显示出杂交带，说明目的基
11、因已经插入染色体DNA中。,答案,(2)DNA分子杂交的原理是什么？除了用于目的基因的检测与鉴定以外，试举例说明还有哪些应用？,答案碱基互补配对原则。还可用于亲子鉴定、刑事侦察、生物亲缘关系确定等。,答案,(3)检测目的基因是否转录出了mRNA，采用分子杂交技术，这种技术与DNA分子杂交技术有何异同？,答案相同之处是都采用分子杂交技术，不同之处是从转基因生物中提取的是mRNA，同样用标记的目的基因作探针，与mRNA杂交，如果显示出杂交带，则表明目的基因转录出了mRNA。,答案,(4)检测目的基因是否翻译出蛋白质的方法是什么？其原理是什么？,答案抗原抗体杂交法。原理是抗原能与相应抗体特异性结合。
12、,2.检测棉花中导入的抗虫基因是否表达的最简便的方法是什么？,答案用叶片饲养棉铃虫，观察棉铃虫是否死亡。,目的基因的检测与鉴定的方法汇总,关于不同分子检测的原理、场所、探针的异同 (1)原理：转录水平的检测原理与复制水平的检测原理是相似的，只是被检测的物质不再是转基因生物的基因组DNA，而是转基因生物细胞内的mRNA；翻译水平的检测，则是利用抗原与抗体特异性结合的原理。 (2)场所：不论是复制水平、转录水平还是翻译水平的检测，都是在体外进行的。 (3)探针：在DNA分子、mRNA分子上检测目的基因是否插入、目的基因是否转录时，用的探针都是放射性同位素等标记的含有目的基因的DNA片段。,归纳总结,_ 分子杂交技术 _杂交,导入植物细胞 导入动物细胞 导入微生物细胞,分子水平检测,_目的基因,课堂小结,检测和 鉴定,DNA分子杂交法,基因工程的基本操作程序,获取目的基因 构建基因表达载体,导入目的基因,_水平的鉴定,抗原抗体,个体,
