1、第二节 脱毒种苗生产及病毒检测技术,一、脱毒的意义： 无性繁殖作物长期营养繁殖，易受病毒侵染，而使病毒在体内积累，导致种性退化，造成产量下降或品质降低甚至死亡，给农业造成巨大损失。 通过茎尖培养获得无病毒种苗，对退化品种进行提纯复壮。提高产量和品质，如马铃薯脱毒可提高产量30-60%,提高了经济效益。此外，由于减少农药使用，可以保护生态环境。 脱毒技术主要应用于各种无性繁殖植物，如草莓、马铃薯、甘薯、苹果、香蕉、甘蔗等。,二、脱毒方法： （一）茎尖分生组织培养脱毒： 1. 脱毒原理：病毒在植物体内的分布不均匀，越靠近顶端区域，带毒越少，顶端分生组织（0.2-0.5 mm）不带病毒或含病毒量极低
2、。因此，分离分生组织细胞进行培养，可以获得无病毒种苗。,2. 茎尖分生组织培养脱毒的基本程序： 一般包括培养基选择和制备、带脱毒材料的表面、灭菌、茎尖分生组织分离、接种和培养、诱导芽分化和小植株增殖、诱导生根、驯化移栽等环节。 茎尖分生组织的分离需要在超净工作台上借助体视显微镜进行。茎尖放在培养皿内进行解剖，一只手用镊子固定，另一手用解剖针将叶片和叶原基层层剥掉，当露出半圆形顶端分生组织时，将分生组织切下，接种与培养基上。,virus-free tissue,virus particles found here,3. 脱毒效果与茎尖大小的关系： 脱毒效果和茎尖分生组织大小直接相关，茎尖分生组织
3、越小，脱毒率越高，但生长速度慢。如草莓茎尖切取0.2-0.3mm时，脱毒率达到100%，而切取1.0mm时，脱毒率为50%。因此，脱毒培养时，需要兼顾脱毒率、成活率及茎尖发育成完整植株的能力。既要脱除病毒，也要使茎尖分生组织迅速生长发育。一般茎尖分生组织大小以0.2-0.5mm为适宜。,（二）微体嫁接脱毒： 微体嫁接是在无菌条件下，将极小(0.2mm）的茎尖嫁接到试管内的无菌实生苗砧木上，经培养，待接口愈合发育为完整植株而达到脱毒的效果。该方法已在柑橘、苹果、葡萄、山茶等园艺植物中应用。,微体嫁接,微体嫁接的方法： （1）试管砧木的准备:将无病毒种子表面灭菌后接种与MS培养基，黑暗条件下培养1
4、5d使其发芽。 （2）茎尖嫁接：在超净工作台上，将幼苗的上胚轴和子叶去掉，根系截短，在离上胚轴顶端越0.5cm处斜向下切一深达木质部，长2-3cm的切口，在斜切口末端横切一刀，用去掉切下部分。在体视显微镜下，从待脱毒样品上切取0.2mm的茎尖分生组织，小心放于切口的水平面上，切面向下并与砧木切口形成层组织紧密贴合，然后接于培养基上。 （3）嫁接苗培养：将嫁接苗置于光下培养，光照时数16h，嫁接1周后形成愈伤组织，2-3周愈合，5-6周后接穗发育为新梢。,2. 微体嫁接脱毒的关键： 影响微体嫁接成活率的主要因素为接穗大小和取样时间。与接穗大小呈正相关，而无病毒植株获得与接穗茎尖的大小呈负相关。茎
5、尖分生组织小于0.2mm可以脱除多数病毒，春季取材嫁接的成活率高于其他季节。,（3）热处理脱毒： 通过热处理可以由受病毒侵染的个体得到无病毒植株，其原理是利用病毒与植物的耐热性不同，在高于常温的环境下，植物组织中的病毒受热后可被部分或全部钝化或失去活性，而寄主植物组织很少或不会受到伤害。或高温下植物生长快，而病毒增殖慢而使植物新生部分不带病毒。,1.热处理脱毒方法： 可以通过温汤浸渍或热空气处理法脱毒，前者对休眠芽效果较好，后者对活跃生长的茎尖效果较好。 热空气处理即把旺盛生长的植物移入热疗室，在35-40下处理一定时间（几分钟到数周）热处理后将茎尖切下嫁接于无病毒砧木或进行组织培养。热处理温
6、度应逐步升高，直到要求温度。 温汤浸渍的材料常用50-55 处理10-50min或35 温水处理30-40min。,2. 热处理脱毒条件： （1）温度和持续时间：因病毒种类而异，有些33-34处理28-33d即可脱毒，而有些必须在39-42 处理50-60d，耐热杆状病毒热处理脱毒效果差。在植物的耐热范围内，温度越高，脱毒效果越好。一般采用35-38 .尤其37恒温处理302天为普遍。也可采用高低温处理减少对植物的损伤。如马铃薯40 （4h）+16-20 （20h）。 （2）湿度和光照：湿度以70-80%为适宜。光照以自然光最好。 （3）前处理：27-35 1-2周。,（四）其他脱毒方法： 花
7、器官培养脱毒：由植物的花器官培养脱分化形成愈伤组织，然后再分化不定芽，可以获得无毒苗。如草莓花药培养。 2. 珠心胚培养脱毒：柑橘类珠心胚与微管组织没有联系，一般不带毒，可以利用珠心胚进行培养获得。 3.化学脱毒:采用病毒唑等试剂处理材料或添加到培养基中可以钝化病毒，达到一定的脱毒效果。 4. 超低温处理脱毒:经过冷冻保护剂处理过的茎尖材料，采用液氮处理（-196）可以钝化病毒，达到脱毒效果，该方法已在香蕉等果树中成功应用。 5. 合并热处理、茎尖培养或微嫁接脱毒：采用多种方法同时处理可以达到更好的脱毒效果。,二、病毒检测方法： 1、形态鉴定： 根据植株的生长状态鉴定是否脱毒，但不准确。 2、
8、指示植物鉴定法：利用特定的易于感染某些病毒的指示植物的特征进行病毒鉴定。,指示植物,CMV病毒感染的植株叶片,3、抗血清鉴定法：利用抗原和抗体的特异性反应原理进行病毒鉴定。用已知病毒的抗血清（antiserum）鉴定未知病毒。 近年来又在此基础上发展出酶联免疫法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA），方法是将抗原固定在支持物上，加入待检血清，然后加入酶（过氧化物酶或碱性磷酸酶）标记的抗体，使待检血清与对应抗原的特异性抗体结合，最后用分光光度计进行诊断。,酶联免疫法进行病毒鉴定,4、电子显微镜检测（Electronmicroscope）：采用电子显微镜
9、对病毒的薄样品（约1100um）或纯化的病毒悬液中进行病毒的直接观察。 5、RTPCR检测（Reverse TranscriptionPolymerase Chain Reaction）：RT-PCR是将RNA模板的反转录（RT）,和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。RT-PCR技术灵敏而且用途广，可用于检测病毒DNA的转录产物，分析表达的水平。该方法已用于大蒜脱毒苗检测。,四、无毒苗的保存与繁殖： （一）无毒苗的保存： 无毒苗木需在隔离条件下保存以防止再度感染病毒，一般在专用的防虫网室进行培养，或者在离体条件下保存。 （二）无毒苗的繁殖： 无毒苗的继代培养与快速繁殖 可采用不定芽或丛生芽等途径进行无毒苗的快繁。 2. 无毒苗的生根及微型鳞茎的培养 生长至1.0-1.5 cm的无毒苗接种于生根培养基诱导生根或在诱导试管鳞茎、试管种薯等培养基上诱导形成脱毒鳞茎、脱毒种薯等繁殖材料。,2010312,
