1、实验七微生物显微计数 -血球计数板法一、目的要求1了解血球计数板的构造和使用方法。2学会用血球计数板对酵母细胞进行计数。二、基本原理利用血球计数板在显微镜下直接计数， 是一种常用的微生物计数方法。 此法的优点是直观、快速。将经过适当稀释的菌悬液 （或孢子悬液） 放在血球计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。由于计数室的容积是一定的（01mm2），所以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目来换算成单位体积内的微生物总数目。由于此法计得的是活菌体和死菌体的总和，故又称为总菌计数法。血球计数板， 通常是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台。中间的平台又被一短横槽隔成两半， 每一
2、边的平台上各刻有一个方格网， 每个方格网共分九个大方格， 中间的大方格即为计数室，微生物的计数就在计数室中进行。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16 个中方格，而每个中方格又分成 25 个小方格；另一种是一个大方格分成25 个中方格，而每个中方格又分成16 个小方格。但无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是相同的，即 16 25=400 小方格。每一个大方格边长为1mm ，则每一大方格的面积为1mm 2，盖上盖玻片后， 载玻片与盖玻片之间的高度为0 1mm，所以计数室的容积为01mm 3。在计数时， 通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上 1
3、6 或 25，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成1ml 菌液中的总菌数。下面以一个大方格有25 个中方格的计数板为例进行计算：设五个中方格中总菌数为A ，菌液稀释倍数为B ，那么，一个大方格中的总菌数因 1ml=1cm 3=1000mm 3，=50000A B （个）同理，如果是16 个中方格的计数板，设五个中方格的总菌数为A，则1三、器材酿酒酵母菌悬液，血球计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细管。四、操作步骤1稀释将酿酒酵母菌悬液进行适当稀释，菌液如不浓，可不必稀释。2镜检计数室在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗后才能进行计数。3加样品将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片
4、， 再用无菌的细口滴管将稀释的酿酒酵母菌液由盖玻片边缘滴一小滴（不宜过多） ，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，一般计数室均能充满菌液。注意不可有气泡产生。4显微镜计数静止 5 分钟后， 将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有510 个菌体为宜。 每个计数室选5 个中格（可选 4 个角和中央的中格）中的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的值来
5、计算样品的含菌量。5清洗血球计数板使用完毕后， 将血球计数板在水笼头上用水柱冲洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。 镜检， 观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。若不干净， 则必须重复洗涤至干净为止。五、实验报告1结果将结果记录于下表中。A 表示五个中方格中的总菌数；B 表示菌液稀释倍数。2思考题根据你实验的体会， 说明用血球计数板计数的误差主要来自哪些方面？应如何尽量减少误差，力求准确？附：血球计数板血球计数板被用以对人体内红、白血球进行显微计数之用，也常用于计算一些细菌、真菌、酵母等微生物的数量，是一种常见的生物学工具。一 . 基本构造2血球计数板是一块特制的厚型载玻片 ，
6、载玻片上有四个槽构成三个平台。中间的 平台 较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各刻有一小方格网，每个方格 网共分九个大格，中央的一大格作为计数用，称为计数区。计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方格又分成25 个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格（大方格之间用双线分开），而每个大方格又分成16 个小方格。但是不管计数区是哪一种 构造 ，它们都有一个共同特点，即计数区都由400 个小方格组成。计数区边长为1mm，则计数区的面积为 lmm2，每个小方格的 面积为 1/400mm2。盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数区
7、的体积 为 0.1mm3，每个小方格的体积为1/4000mm3。使用血球计数板计数时， 先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每 毫升菌液（或每克样品）中 微生物 细胞的数量。二 . 使用方法（ 1）视待测菌悬液浓度，加无菌水适当稀释（斜面一般稀释100 倍），以每小格的菌数可数为度。（ 2）取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片 。（ 3）将菌悬液摇匀，用滴管 吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一小滴（不宜过多），让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸 吸去沟槽中流出的多余菌悬液。 也可以将菌悬液直接滴加在计数区上（不要使计数区两
8、边平台沾上菌悬液，以免加盖盖玻片 后，造成计数区深度的升高），然后加盖盖玻片（勿使产生气泡）。（ 4）静置片刻，使细胞沉降到计数板上，不再随液体漂移。将血球计数板放置于显微镜 的载物台上夹稳， 先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。由于生活细胞的折光率和水的 折光率 相近，观察时应减弱光照的强度。（ 5）计数时若计数区是由16 个大方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4 个大方格（即100 小格）的菌数。如果是25 个大方格组成的计数区，除数上述四个大方格3外，还需数中央1 个大方格的菌数（即80 个小格）。为了保证计数的准确性，避免重复计数和漏记， 在计数时， 对沉
9、降在格线上的细胞的统计应有统一的规定。如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。 即位于本格上线和左线上的细胞计入本格， 本格的下线和右线上的细胞按规定计入相应的格中。见右图： 即本格中计数细胞为 3 个。（ 6）对于出芽的酵母 菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。每个样品重复计数 2-3 次（每次数值不应相差过大，否则应重新操作），按公式计算出每mL（ g）菌悬液所含细胞数量。（ 7）测数完毕，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存。三 . 计数公式（ 1）、
10、 16 格 25 格的血球计数板计算公式：细胞数 /ml=100 小格内细胞个数/100 400 10000稀释倍数（ 2）、 25 格 16 格的血球计数板计算公式：细胞数 /ml=80 小格内细胞个数/80 40010000稀释倍数四 . 不足之处血球计数板在 显微镜 下直接进行测定。 它观察在一定的容积中的微生物 的个体数目， 然后推算出含菌数， 简便快捷。但是在计数时包括死活细胞均被计算在内，还有微小杂物也被计算在内。这样得出结果往往偏高，因此适用于对形态个体较大的菌体 或孢子 进行计数。五 . 误差来源4血细胞计数的误差分别来源于技术误差 和固有误差。其中由于操作人员采血不顺利，器材
11、 处理、使用不当， 稀释不准确， 细胞识别错误等因素所造成的误差属技术误差；而由于 仪器（计数板、盖片、吸管等）不够准确与精密带来的误差称仪器误差，由于 细胞分布不均匀等因素带来的细胞计数误差属于分布误差或计数域误差（filederror）。仪器误差和分布误差统称为固有误差或系统误差。技术误差和仪器误差可通过规范操作、提高熟练程度和校正仪器而避免或纠正，但细胞分布误差却难于彻底消除。因此，搞好红细胞 计数的质量控制一般需采用以下措施。1避免技术误差，纠正仪器误差（ 1）所用器材均应清洁干燥，计数板、血盖片、微量吸管及刻度吸管的规格应符合要求或经过校正。计数板的鉴定：要求计数室的台面光滑、透明，
12、划线清晰，计数室划线面积 准确。必要时采用严格校正的目镜测微计测量计数室的边长与底面积，用微米千分尺测量计数室的深度。 美国国家标准局（ NBS）规定每个大方格边长的误差应小于1%，即 1 0.01mm，深度误差应小于 2%，即 0.1 0.002mm。若超过上述标准，应弃之不用。血盖片应具有一定的重量，平整、光滑、无裂痕，厚薄均匀一致， 可使用卡尺多点测量 （至少在9 个点），不均匀度在 0.002mm之内。必要时采用平面平行仪进行测量与评价，要求呈现密集平行的直线干涉条纹。最简单的评价方法是将洁净的盖片紧贴于干燥的平面玻璃上，若能吸附一定的 时间不脱落，落下时呈弧线形旋转，表示盖片平整、厚
13、薄均匀。同时，合格的盖片放置在计数室表面后，与支持柱紧密接触的部位可见到 彩虹 。精选出的盖片与其他盖片紧密重合后，在掠射光线下观察， 如见到完整平行的彩虹条纹表示另一枚盖片质量也符合要求。目前临床实验室多采用一次性微量采血管采集毛细血管血， 除注意定点购买使用信誉较好厂家的产品外，还应对每一批量的采血管进行抽样检查，可通过水银称重法或有色溶液比色法进行校正，误差不应超过1%。（ 2）红细胞稀释液应等渗、新鲜、无杂质微粒。（ 3）严格操作，从消毒、采血、稀释、充池到计数都应规范 ，尤其应注意的是血样稀释及充池时既要作到充分混匀， 又要防止剧烈震荡为破坏红细胞。必须一次性充满计数室，防止产生气泡
14、，充入细胞悬液的量以不超过计数室台面与血盖片之间的矩形边缘为宜。（ 4）报告法定计量 单位 。2缩小计数域误差或分布误差由于血细胞在充入计数室后呈随机分布或称Poisson分布（），而我们所能计数的细胞分布范围是有限的，由此造成的计数误差称为计数域误差或分布误差。缩小这种误差的有效方法就是尽量扩大细胞计数范围和计数数目，一般先进行误差估计，然后决定所需计数的数目和计数范围，只要能将误差控制在允许范围内即可。Berkson 指出，当使用同一支吸管、同一面计数室，计数0.2mm2面积的细胞数，有望将CV控制在可接受的7%以内。对于红细胞计数而言， 由于红细胞数量较多，在计数室中显得比较 “拥挤”，
15、根据 Poisson公式推断。欲将误差控制在变异百分数 5%以内，至少需要在计数室中计数400 个红细胞，因此要求计数五个中方格的红细胞。事实上Berkson还通过实验证明，红细胞的计数域误差为s=0.92 ，较 理论 误差（ Poisson分布误差）要小。3排除异常 标本的干扰白细胞数量在正常范围时，相对于红细胞数量来讲，其影响可忽略，但如白细胞过高 （ 100 109/L ），则应对计数结果进行校正。 方法是：实际 RBC=计得 RBC-WBC。如当红细胞换算后为 3.5 1012/L 、白细胞换算后为100 109/L 时，病人实际红细胞数应为53.4 1012/L 。在高倍镜下计数时，
16、避开有核细胞。有核细胞体积比正常红细胞大，中央无凹陷，无草黄色折光，可隐约见到 细胞核 。此外， 当病人急性严重贫血时网织红细胞可提前大量释放， 也给红细胞计数带来一定的干扰，而且影响网织红细胞绝对值计算结果。其校正方法有待探讨。六微生物计数实验1. 基本原理此法是利用血球计数板在显微镜 下直接进行测定。它观察在一定的容积中的微生物的个体数目，然后推算出含菌数，包括死活 细胞 均被计算在内， 还有微小 杂物 也被计算在内。 这样得出结果往往偏高。这种方法常用于形态个体较大的菌体或孢子 。2. 方法与步骤（ 1）、取洁净的血球计数板，在计数室上面盖上盖玻片。（ 2）、取稀释到一定程度（ 510
17、个酵母 / 小格） 酵母液 ，从盖片边缘滴一小滴，使菌液自行渗入，计数室内不能有气泡。先在低倍镜下找到小方格网后，再转换高倍镜 观察并计数。3、如用 16X25 计数板， 只计四个角上中方格的菌数。若是 25X16 的计数板， 除计数四个角上的中格菌数外， 还要计算中央中格的菌数。每个样品重复计数23 次。计数时应不时调节焦距 ，才能观察到不同深度的菌体。4、位于格线上的酵母菌一般只计此格的上方线及左方线上的菌体。5、计数方法：样品中菌数 /ml= 每小格平均菌数x4000,000x 稀释倍数，本实验采用25x16 规格，要求数这些方格中的全部小格即80 个小格。设：每个中方格的菌数为A，则每小格平均菌数=（ A1+A2+A3+A4+A5)/80样品中的菌数 /ml= （ A1+A2+A3+A4+A5） /80X4000,000X 稀释倍数结果记录微生物名称总菌数个 /ml6测定注意事项 :1、测定时，酵母菌液要摇匀，防止酵母凝聚沉淀。2、活酵母有芽殖现象，若芽体达到母细胞大小的一半时，即可作为两个菌体计数，若芽体小于母细胞一半时为1 个酵母细胞。3、位于格线上的酵母菌一般只计此格的上方线及左方线上的菌体。第一个第二个第三个第四个第五个中格中格中格中格中格第一次测定第二次测定平均7
