1、基因工程RRSV-S4基因的克隆表达实验设计1. 酶切位点的选择2.载体的酶切方案3.引物的设计及合成4.实验流程1. 酶切位点的选择（1） RRSV-S4基因的下载（2）RRSV-S4-ORF的获取 atgactctattagtgatcaccgagcagaccatacattcactgtgtctcgaccacggagaaactaaccagattatcgcggagattaaacaacttgagaagccagaactcttattttcatatatcacggacgccgaacctttagcaaccggagaagtatttgtaggacccgacatctgcggcaattgtataacccatactt
2、tcagagttcccgactacgtcgcgaaaccccctccttatgattcgaagcgcgtgtattatccgtactcttatacttgtttgggcttcgatagtcacccttacgattatttgcttactttagatactaagtcaatattccaagcaattcggaaaattactctaacgcgtaagctatcaattgccacacagtccgatctggatctaattattttaaagaagttgactacacaatcaaattgccaatcgcgcgtgtctagtatttggcgtcagtgtgtagcagcatgcctagcgttcgagcctc
3、agatccaaaacaacaactctacccaatcgccgaacttgaacaacttagtcaagaggatgttcgcaacattgctaaaacccatcggtcgcctacccttctacgaacgcagacgaaattttgtgtgggaagaagaggtgagttgtcctacgatactacccttgctcctttacagtattcagaacctggtgactcaattttgcgcgggagtgataaacaggatggaaatgattctagcctttcaatattatctagactgtggtgttacggcgtatcaagacgaaaagctcaggcttcagaaat
4、tgattcggaattggttgcgcgagggattagcaaagttctcgaagatagccatgccaaattggacggtttcgggagtcatcagctgtacgacagtcaaacctataatgattactactcacgaagcgcgggaaatcaaatcagcgagagaggcgagggaggcgagcgttccaacttatttattgcagtacataaaccacgccatccacaaagctatcagcccgtatcagacccatcagtattggcaggctacgagagtgttcgcgaacgacgggacgtatttcgcttcggtggcggcactaa
5、ctttgaacaaggcggttcgaccgagaatagaggaaactacagtgaaatacccgaactcacgttacttaactatgaacaaggaacacatagcagtctcattaccgaacgagacggatacaaattttggtctggcatgtcaatttgtgaaacaatttataccgcgactcgtgacgagattgaagaatacgaactttcaagaggaattcatagcgttcctaacatcatcgagctcaggcaaagacttcgaagacgcagccatcgcaactatgacgcgaaccattcaacgagtggcgaagaaga
6、gaatagtggcagcaggtctagaatcgcggagttatctcaatcaacaattcatcgccgatgagtgcttagccgccgcaaaattagtgggtcgcacccagattggaaggagacagagagctattgctggtgtcaataatactcgttcactgttaggattccctcctatgttaatgttaaaagcgttgctggatatgacaggaactacctcgtccgggaaacagatgggtaattatttagatttgttaattcctctcggattatcaccatacgctaatgtgattttcaattcggcggatgtgg
7、atgcaatggatgctagtgtgcaggcctcagttcagcaaataatgtggcattttgttgtgtacatagctttacaattggaacgtacagattattttgcttttacctcgggagatgaagtgatatatgagctagttgaaggaaaggattcagttgctaccagtattcatatgagtggtcttgcaagatcttgtttacgcgcaatgcatttacttcagccacagaattgtgtattgaacgatgacatcgtcggggagttagtcactcgtgagcccacctttccttctggtcagccgtttacga
8、cagtccatcacacctttacattgtcaaatgctatcatgggtggtactttgagagtgaccaatctcaccaatcagccatcgacactacttaatctaacggtgcaaggggatgatacaagaaccatcaactatggacccaagggttgcatcgaaaagtgcattgatgatcaatcgtctttcgtgagtgattggggctttaaagtctcgaacgagacgtcatctcacacttcggaatatttacaacagcgtgtttcatgtggtacctttgtcggatacccagatcgagtttcattatttgcag
9、cagaacggccaaaagaaggcaagacgatgaaagagaagatgtcagaaatttggagtttggttacggatttgggttgtcgctctagagatccgcagcgattggttcgattgatgtatgctattggagtagcgtgctgttgtcgattaactataaggacagagaggcttgtagcagaagagttcatcgcatcagaggttggtcgagcatgctgtgctgagattttagtgccaaaagttgcagcaagggcggatagaggtgtaatgttgcggtaccactaccctatcagtgctctttggttag
10、aagaaggaggccagctaccacctttagcgactaaaagaagggacggcacttggacgtgttttcccagttactacttccaacgcggcgactctaaccgatattggtattgggatgttagtctcactgaagagaagtggataactacagtggagatgcgctccgactgggactcgaataacgctatcgagctgatagacgatgagattcttgaagcatatgccactagatatgctctggccgcgttggggctcaataaaacccgtcagatggaaaggttgcgattgagcgaagaatcgacta
11、tattcgatgttgagcagctagcttccgggctgaatgcttatcgtaatcttagtaaaatagcgatatcgcatagagcatctgagcggttaaagaatgccggagtagagttgcctgatagcgtgttgtatagtcgccatacccaatccaggatacaagatgcaatactcaaggcgcaaatgacagaaaaggaagaaattgagatgtcattgtacttctttaaagacaaaggttatcttagatcacttcgtgaattagtgaagtctaaatcaggcgatttggctatgatacataggtgcgaat
12、ggggtgagcgagttactattcttgaatcttcaatattcaacgtagtttcgaccactccattatcaatggaagtgtacccgggttcgataatgtccttcattttatgttataccggactcaaaggtgctcatagtggacaattggctggtttagtaggtttgttacaaggtaaatacggcggtgggaagattagcgaacttcagttttcgatagcaaagaaaatctatctaactaaaccatatttgttaaacgaatttatcatagcttgcggtctcggcggcgaagcggaattagccctta
13、aaaacgctcttcatgcattcgaaatgttacgaggcgttgagttttcaacggtacacaccccaaggcagtttttctttggtgttgattcgggagttacgcttggtaatcatcttgactacccaaacggattcccaggaacgagaattgagttagcggcacacctgttattagcgatgaatttcttaagttctaacgctcagtcctgtaccggtaggtctattcgtgtacgagtaccaagggggatgtggtcgcggtgtacgaacttc(3) 表达质粒pTXB1 MCS的分析RRSV-S4-ORF酶谱分
14、析：由RRSV-S4-ORF酶谱分析可知：只有NotI和XhoI可用，查得两个限制性内切酶的反应温度为37，查得两酶的通用Buffer为1H+BSA，分析两酶是否为同尾酶NotI GCGGCCGC CGCCGGCGXhoI CTCGAG GAGCTC得为非同尾酶2.载体的酶切方案Not ITTGCGGCCGCAA ATTTGCGGCCGCTTTA AAATATGCGGCCGCTATAAA ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTAT AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA0 10 10 25 250 10 10 90 90Xho ICCTCGAGG CCCTCGAGGG
15、CCGCTCGAGCGG0 10 100 25 75载体酶切方案为： 1H+BSA buf, 37, NotI和XhoI酶切20 hours以上。3引物设计第一步： 第三步：由软件得出的结果有三对，取其中一对：第四步得出引物为：P+:(Not 1 ) 5ATAAGAATGCGGCCGCATGACTCTATTAGTGATCACCG 3P-( Xho I):5CCGCTCGAGGAAGTTCGTACACCGCGACC 3 送公司合成, 2 OD, 1OD/tube分装.使用时加ddH2O至10 pmol/ul浓度.4.实验流程 实验流程电泳鉴定 RRSV-dsRNA 抽提 PTXB1质粒的提取 电
16、泳鉴定 电泳鉴定 RT-PCR扩增S4基因引物合成 Not1和Xho1双酶切 Not1和Xho1双酶切 胶回收 胶回收 电泳鉴定浓度 16连接过夜 感受态细胞的制备 转化ER2566感受态细胞 阳性克隆的筛选 测序验证RRSV-dsRNA抽提：RRSV感染的病稻,切碎研磨,加入抽提缓冲液加入酚,裂解细胞,变性蛋白离心,得上清(含DNA, mRNA, dsRNA等核酸)CF11柱可以特异吸附dsRNA获得纯化的dsRNA,电泳鉴定RT-PCR反应1. dsRNA, P+,P-混合物, 加热1005min,2.快速插入冰中,3. 加入RT缓冲液和RTase,反应1h4. 取部分RT产物,作为PCR反应的底物,配好PCR反应体系,PCR扩增，电泳鉴定.基因, 载体的双酶切1基因可同时双酶切(1 * H +BSA缓冲液,37度)！2载体pTXB1可同时双酶切(1 * H +BSA缓冲液,37度)！基因和载体浓度鉴定按照基因mol数:载体mol数=10:1,进行连接并转化感受态细胞 克隆的Amp抗性筛选 PCR筛选 Not1和Xho1双酶切筛选表达筛选 测序验证
