1、细菌G染色体、细菌群体特征、放线菌形态观察一、 实验目的1、 观察细菌菌落的特征，掌握革兰氏染色体的原理及操作步骤，并在油镜下观察细菌个体的形态。2、 辨认放线菌的营养菌丝、气生菌丝、孢子丝、包子形态，学习放线菌的观察方法。二、 实验原理细菌的群体特征又叫培养特征，有菌落形态特征、液体培养特征、琼脂斜面生长特征以及穿刺培养特征。细菌菌落大多数表面光滑湿润，有光泽，一般菌落较小，质地颜色均匀、多样，同培养基结合不紧密。菌落特征包括大小、形状、边缘形态、表面状况、颜色和透明程度，与组成菌落的细胞结构、生长状况、排列方式、好气性和运动性等相关。细菌个体微小，且较透明，必须借助染色体法使菌体着色，显示
2、出细菌的一般形态结构及特殊结构，在显微镜下用油镜进行观察。革兰氏染色：主要原因是由于革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）的细胞壁的构造不同。细菌经初染和煤染，在细胞内形成深紫色的结晶紫-碘复合物，当用酒精脱色时，G+细胞壁的肽聚糖层网状结构孔径收缩以致关闭，阻止不溶性复合物结晶紫-碘的逸出，这样使菌体呈色。G-脂类物质溶解，结晶紫-碘复合物随之被抽提，固菌体呈复染后的红色。放线菌的丝状体可分为营养菌丝、气生菌丝和孢子丝，放线菌用美兰染色后，可观察其形态。三、 实验步骤（一） 革兰氏染色体1、 涂片： 取洁净载玻片，在火焰上微热，除去油脂，冷却，在中央滴一小滴无菌水，用接种环接种（取菌量不
3、要过大）。2、 干燥：涂布后，待其自然干燥。3、 固定：将已干燥好的涂片标本向上，在微火上通过7次进行固定。4、 染色：A、初染：在涂片处结晶紫12滴，染色90sB、煤染：滴加碘液，染90s，水洗；C、脱色：滴加95%乙醇，脱色15s，立即水洗，以终止脱色。D、复染：滴加沙黄，染色150s，水洗后晾干，也可用吸水纸轻轻吸干。5、 镜检：干燥后，置油镜下观察。（二） 菌落特征观察 分别从正面、侧面观察大肠杆菌，枯草芽孢杆菌的菌落特征（包括大小、色泽、透明度、边缘和表面隆起形状）。（三） 放线菌形态观察1、 制片： 用镊子从培养皿中取出已经培养47天地盖玻片，放置在已滴加美兰的载玻片上，用吸水纸吸
4、取盖玻片周围多余的美兰液，放在显微镜下观察。2、 镜检： 先用低倍镜，后用高倍镜观察，仔细观察放线菌的营养菌丝、气生菌丝和孢子丝等。四、 实验结果1、 描述大肠杆菌、枯草芽孢杆菌的菌落特征菌名菌落特征斜面生长特征大小（mm）形状边缘表面颜色透明度正面侧面大肠杆菌1.5圆形扩展（扁平）圆锯齿形光滑浅黄色半透明扩展状枯草芽孢杆菌2圆形低凸面波状细颗粒白色不透明念珠状2、 绘图：画出在显微镜下观察到的微生物的个体形态图3、 记录两种菌的革兰氏染色结果，分辨出G+和G-，如果染色不理想，请分析原因。菌种名称革兰氏染色后的菌体颜色结果大肠杆菌红色G-枯草杆菌紫色G+4、 观察菌落特征，并按下表要求记录。
5、菌种培养特征气丝颜色孢子丝颜色基丝颜色色素组织状态其他特征灰色链球菌灰色灰色灰白色灰色簇状同心环状（正面）五、 实验注意事项1、 涂片的过程中，滴水量要小，便于干燥；取菌量不应过大，避免菌体重叠。2、 固定的作用：杀死细菌；使菌体蛋白质凝固，菌体牢固黏附在载玻片上，染色时不被染液或水冲掉；增加菌体对染料的结合力，使涂片易着色。3、 冲洗时，流水量不应过大，水流不得直接冲在涂菌处，以免将菌体冲掉。4、 脱色时间要严格控制，不能太长或太短。六、 思考题1、 为什么必须用培养24h以内的菌进行革兰氏染色？ 答：因为培养24h以内的菌落处于生长活跃期，各项生理指标都正常，如果时间较长，菌落的细胞老化，
6、细胞壁成分发生变化，部分阳性菌会出现假阴性，染色结果导致错误。2、 要得到正确的革兰氏染色结果，必须注意哪些操作？哪一步是关键步骤，为什么？答：注意事项选用幼龄的细菌，若菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应；染色过程勿使染色液干涸，用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色体被稀释而影响染色结果。关键步骤：酒精脱色，如果脱色过渡，G+可被脱色染成阴性菌，如果脱色时间过短，G-也会被染成革兰氏阳性菌；脱色时间的长短还受涂片薄厚及乙醇用量多少等因素的影响。3、 当你对未知菌进行革兰氏染色时，怎样保证操作正确，结果可靠？ 答：找事先已知的且和未知菌形态明显不同的G+和G-分别作混合涂片，当和G+
7、混合做革兰氏染色时，操作正确显紫色；当和G-混合做革兰氏染色时，操作正确显红色，看未知菌分别显什么色，若一致则可认为操作此菌为G+或G-，然后，再单独做未知菌的革兰氏染色，进行验证。4、 比较细菌和放线菌的主要区别，两者最主要的鉴别特征是什么？答：细菌放线菌形态结构细胞细短，形态简单（主：球状、杆状、螺旋状），胞壁坚韧细胞呈丝状分枝，菌丝直径很细，有孢子丝，多核的单细胞状态繁殖主要为裂殖（二分裂、三分裂、复分裂），少数为芽殖 借孢子繁殖（分生孢子、胞囊孢子） 借菌丝繁殖（基内菌丝断裂、任何菌丝片段）群体特征（固）一般呈现湿润、较光滑、较透明、较粘稠，易于挑取，质地均匀菌落正反面或边缘与中央部位的颜色一致（液）多数表现为混浊，部分表现为沉淀，或形成菌膜（固）干燥，不透明，表面呈致密的丝绒状，上有一层薄层彩色的“干粉”，难以挑选，菌落的正反面颜色不一致，在菌落边缘的琼脂平面有变形（液）培养液清而不混，悬浮着许多珠状菌丝团，一丝大型菌丝团则沉在瓶底两者主要的鉴别特征是在固体培养基上的群体特征明显不同，可以此来判断。
