1、1第六章 培养基的灭菌 知识要点和教学要求1） 、了解空气灭菌的要求和方法2） 、掌握空气过滤除菌流程3） 、掌握空气的预处理4） 、掌握空气的过滤除菌原理和介质 能力培养要求通过本章节的学习，学生能掌握空气灭菌的要求和方法及空气过滤除菌流程。 教案内容一、 消毒与灭菌的区别 消毒与灭菌在发酵工业中均有广泛应用。消毒是指用物理或化学方法杀死物料、容器、器具内外的病源微生物。一般只能杀死营养细胞而不能杀死细菌芽孢。例如，用于消牛奶、啤酒和酿酒原汗等的巴氏消毒法，是将物料加热至 60 维持 30min，以杀死不耐高温的物料中的微生物营养细胞。灭菌是用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物，包括营
2、养细胞、细菌芽孢和孢子。 消毒不一定能达到灭菌要求，而灭菌则可达到消毒的目的。 二、 培养基灭菌时间计算 1. 分批灭菌（实罐灭菌）如果不计升温阶段所杀灭的菌数，把培养基中所有的菌均看作是在保温阶段（灭菌温度）被杀灭，这样可以简单地利用式 14-1，粗略地求得灭菌所需的时间。 例 14-1 有一发酵罐内装 40m3 培养基，在 121 温度下进行实罐2灭菌。原污染程度为每 1mL 有 2*105 个耐热细菌芽孢， 121 时灭菌速度常数为 1,8min-1。求灭菌失败机率为 0.001 时所需要的灭菌时间。2. 连续灭菌 连续灭菌的灭菌时间，仍可用式 14-1 计算，但培养基中的含菌数，应改为
3、每 1mL 培养基的含菌数，则式 14-1 变换为下式： 式中：c0 及 cs 分别为单位体积培养基灭菌前和灭菌后的含菌数，（个/mL ） 。 例 14-3 若将例 14-1 中的培养基采用连续灭菌，灭菌温度为131，此温度下灭菌速度常数为 15min-1，求灭菌所需的维持时间。 第六章空气灭菌 空气除菌不净是发酵染菌的主要原因之一。比如一个通气量为40m3/min 的发酵罐，一天所需要的空气量高达（5.76*104）m3 ，假如所用的空气中含菌量为 104 个/m3 ，那么一天将有 5.76*108 个微生物细胞进入发酵罐，这么多的杂菌带入，完全可导致发酵失败。因此，空气的灭菌是好氧培养过程
4、中的一个重要环节。 空气灭菌的要求和方法 空气中生物种类及其分布 空气主要是由氮气和氧气、二氧化碳、惰性气体、水蒸汽以及3悬浮在空气中的尘埃等组成的混合物。空气 中含有大量的微生物，除常见的细菌外，还有酵母真菌和病素养，据统计一般城市的空气中含菌量为 103-104 个/m3 。空气中常见的微生物大致有金黄色小球菌、产气杆菌等，见表 6-1 表 6-1 空气中常见的微生物种类及其大小 微生物（菌种）宽（m） 长（） 产气杆菌 1.0-1.5 1.0-2.5 蜡状芽苞杆菌 1.3-2.0 8.1-25.8 普通变形杆菌 0.5-1.0 1.0-3.0 地衣芽孢杆菌 0.5-0.5 1.8-3.3
5、 巨大芽苞杆菌 0.9-2.1 2.0-10.0 覃状芽苞杆菌 0.6-1.6 1.6-13.6 枯草芽苞杆菌 0.5-1.1 1.6-4.8 普通变性杆菌 0.5-1.0 1.0-3.0 金黄小球菌 0.5-1.0 0.5-1.0 酵母菌 3.0-5.0 5.0-19.0 病素 0.0015-0.225 0.0015-0.28 霉状分枝杆菌 0.6-1.6 1.6-13.6 空气中的微生物是依附在尘埃上的，空气中的尘埃数与细菌数的关系如式 6.1 和图 6-1 所示。 Y=0.003x-2.6 式中，y-空气中的微生物数量（个/m3 ） ，x-空气中的尘颗粒数量（个/m3） 。 6.1 空气
6、灭菌的要求和方法 各种不同的培养过程，鉴于其所用菌种的生长能力强弱、生长速度的快慢、培养周期的长短以及增基中 PH 差异，对空气灭菌的要求也不相同。所以，对空气灭菌的要求应根据具体情况而定，但4一般仍可按 10-3 的染菌机率，即在 1000 次培养过程中，只允许一次是由于空气灭菌不彻底而造成染菌，致使培养过程失败。 空气灭菌的方法大致有如下几种： 1 热灭菌法 鉴于空气在进入培养系统之前，一般均需用压缩机压缩，提高压力，所以空气热灭菌时所需的温度提高，就不必用蒸汽或其他载热体加热，而可直接利用空气压缩时的温度升高来实现。一般来说，欲杀死空气中的杂菌，在不同温度下所需的时间大致为表 6-2 所
7、示。表 6-2 不同温度下杀微筇不知所措民需时间 温度（） 所需时间（s） 200 15.1 250 5.1 300 2.1 350 1.05 所以，若空气经压缩后温度能够升到 200 以上，保持一定时间后，便可实现干热杀菌。根据多变压缩公式： T2=T1（P2/P1）m-1/m 若进气温度为 60-70，那么当 P2/P1=6 时，据式（ 6.2）便可知，经压缩机压缩后的空气温度将升高至 200 以上，便可进行热灭菌。因此，空气热灭菌的流程设计时通常是先预热至 60-70 后进入压缩机压缩，并在 200 以上的温度下维持一段时间，以杀死杂菌，如图6-2 所示。 52 辐射杀菌 3 静电除菌
8、4 介质过滤除菌法 过滤除菌法是让含菌空气通过过滤介质，以阻截空气中所含微生物，而取得无菌空气的方法。通过过滤除菌处理的空气可达到无菌，并有足够的压力和适宜的温度以供耗氧培养过程之用。该法是目前广泛应用来获得大量无菌空气的常规方法。将在下节中详细介绍。 6.2 空气过滤除菌流程 6.2.1 对空气过滤除菌流程的要求 供气设备空气压缩机，过滤除菌设备，地理、气候环境和设备条件 6.2.2 空气除菌流程的分析 要保持过滤器在比较高的效率下进行过滤，并维持一定的气流速度和不受油、水的干扰，则要有一系列的加热、冷却及分离和除杂设备来保证。空气过滤除菌有多种流程，下面分别介绍几种较典型流程。 1 两级冷
9、却、加热除菌流程 图 6-4 为两级冷却、加热除菌流程示意图。它是一个比较完善的空气除菌流程， 可适应各种气候条件，能充分地分离油水，使空气达到低的相6对湿度下进入过滤器，以提高过滤效率。该流程的特点是两次冷却、两次分离、适当加热。两次冷却、两次分离油水的好处是能提高传热系数，节约冷却用水，油水分离得比较完全。经第一冷却器冷却后，大部分的水、油都已结成较大的雾粒，且雾粒浓度较大，故适宜用旋风分离器分离。第二冷却器使空气进一步冷却后析出一部分较少小雾粒，宜采用丝网分离器分离，这样发挥丝网能够分离较小直径的雾粒和分离效果高的作用。通常，第一级冷却到 30-35，第二级冷却到 20-25。除水后，空
10、气的相对湿度仍是 100%，须用丝网分离器后的加热器加热将空气中的相对湿度降低至 50%-60%，以保证过滤器的正常运行。 两级冷却、加热除菌流程尤其适用于潮湿的地区，其他地区可根据当地的情况，对流程中的设备作适当的增减。 2 冷热空气直接混合式空气除菌流程 该流程适用于中等湿含量地区，但不适合于空气湿含量高的地区。 3 高效前置过滤空气除菌流程 此流程的特点是采用了高效率的前置过滤设备，使空气经多次过滤，因而所得的空气无菌程度比较高。 4 将空气冷却至露点以上的流程 图 6-7 为将空气冷却至露点以上的流程。它将压缩空气冷却至露点以上，使进入过滤器的空气相对湿度为 60%-70%以下。这种流
11、程适用于北方和内陆气候干燥地区。 75 利用热空气加热冷空气的流程 6 一次冷却和析水的空气过滤流程 综合分析上述各个典型的空气过滤除菌流程可知，空气过滤除菌的工艺过程一般是将吸入的空气先经前过滤，再进空气压缩机，从压缩机出来的空气先冷却至适当的温度，经分离除去油水，再加热至适当温度，使其相对湿度为 50%-60%，再通过空气过滤器除菌，得到合乎要求的无菌空气。因此，空气预处理是保证过滤器效率能否正常发挥的重要部分。 6.3 空气的预处理 空气预处理过程主要是围绕两个目的来进行的：一是提高压缩前空气的洁净度；二是去除压缩后空气中带的油水。 6.3.1 提高压缩前空气的洁净度 通常采用布袋过滤器
12、、填料过滤器、油浴洗涤和水雾除尘装置等。 6.3.2 空气压缩和压缩空气的冷却 若将此高温压缩空气直接通入空气过滤器，会引起过滤介质的炭化或燃烧，而且还会增大培养装置的降温负荷，给培养温度的控制带来困难，同时高温空气还会增加培养液水分的蒸发，对微生物的生长和生物合成都不利，因此要将压缩空气降温。 6.3.3 压缩空气的除水除油 经冷却降温后的空气相对湿度增大，会析出水来，使过滤介质受潮失效，因此压缩后的湿空气要除水，同时由于空气经压缩机后8不可避免地会夹带润滑油，故除水的同时尚需进行除油。 因此，根据上述原理，当空气压缩后，经过冷却，就会有大量水蒸汽及油分凝结下来，使过滤介质受潮，从而使过滤器
13、失效，因此尚需进行油水分离。 分离空气中的油水有两类设备可供选用，一类是利用离心力进行沉降的旋风分离器，另一业是利用惯性进行拦截的介质过滤器。 介质过滤器是利用块状介质、颗粒状介质、网状介质或高分子材料丝网的惯性拦截作用来分离空气中水滴或油滴的方法。在各种介质过滤器中丝网分离器具有较高的分离效率，它对直径大于 5 的颗粒分离效果可达 99%，大于 10 的更可高达 99.5%，且能除去部分2-5 的较细颗粒，加上结构简单，阻力不大等，被广泛应用于生产中。图 6-13 为丝网分离器的示意图。 丝网过滤器常用的丝网有不锈钢、镍、铝、铜、聚乙烯、聚丙烯、涤纶、锦纶等，生产上常用的是 0.25*40
14、目的不锈钢丝网。 6.3.4 空气的加热和贮气罐 前已述及，压缩空气冷却至一定温度，分去油水后，空气的相对湿度仍为 100%，若不加热升温，只要温度稍微有降低，便再度析出水分，使过滤介质受潮而降低或丧失过滤效能。所以必须将冷却除去水分后的压缩空气加热到一定温度，使相对湿度降低，才能输入过滤器。 6.4 空气的过滤除菌原理和介质 6.4.1 空气过滤除菌原理 9空气过滤所用介质的间隙一般大于微生物细胞颗粒，那么悬浮于空气中的微生物菌体何以能被过滤除去呢？这是依靠气流通过滤层时，基于滤层纤维的层层阻碍，迫使空气在流动过程中出现无数次改变气速大小和方向的绕流运动，从而导致微生物微粒与滤层纷纷间产生撞
15、击、拦截、布朗扩散、重力及静电引力等作用，从而把微生物微粒截留、捕集在纷纷表面上，实现了过滤的目的。如图 6-15 为过滤除菌时各种除菌机理的示意图。 1 布朗扩散截留作用 2 拦截留作用 3 惯性撞击截留作用 4 重力沉降作用 5 静电吸引作用 6.4.2 空气过滤除菌的介质 用于空气过滤的过滤介质有纤维状物或颗粒状物、过滤纸、微孔滤膜等各种类型。 1 纤维状或颗粒过滤介质 该类介质主要有棉花、玻璃纤维、活性炭等。 2 过滤纸类介质 这类过滤介质主要是玻璃纤维纸 3 微孔滤膜类过滤介质 微孔滤膜类过滤介质的空隙小于 0.5，甚至小于 0.1，能将空气中的细菌真正滤去，也即绝对过滤。绝对过滤易
16、于控制过滤后的空10气质量，节约能量和时间，操作简便。微孔滤膜类过滤介质用于滤除空气中的细菌和尘埃，除有滤除作用外，还有静电作用。通常在空气过滤之前应将空气中的油、水除去，以提高微孔滤膜类过滤介质的过滤效率和使用寿命。 6.4.3 提高过滤除菌效率的措施 鉴于目前所采用的过滤介质均需要在干燥条件下才能进行除菌，因此需要围绕介质来提高除菌效率。提高除菌效率的主要措施有： 1.减少进口空气的含菌数。方法有： 加强生产场地的卫生管理，减少生产环境空气中的含菌数； 正确选择进风口，压缩空气站应设上风向； 提高进口空气的采气位置，减少菌数和尘埃数； 加强空气压缩前的预处理。 2.设计和安装合理的空气过滤器，选用除菌效率高的过滤介质。3.设计合理的空气预处理设备，以达到除油、水和杂质的目的。4.降低进入空气过滤器的空气的相对湿度，保证过滤介质能在干燥状态下工作。方法有： 1） 使用无油润滑的空气压缩机； 2） 加强空气冷却和去油、水； 提高进入过滤器的空气温度，降低其相对湿度。
