1、Leica TCS SP2 Confocal Spectral Microscope ( UV-VIS )雷射掃描共軛焦分光光譜顯微鏡簡易使用流程(modified by Dr. Chien),因為樣品的差異性頗高, 所以, 本操作流程僅是提供一套簡易流程, 供使用人員參考. 然而, 最佳的使用控制調整, 應該以您個人使用中的樣品為唯一準則.美嘉儀器 共軛焦小組 編製 TEL : 02-2808-1452 / E-mail : .tw 緊急聯絡 : 0933-267 613 ( 24 hours on-call ),系統簡介 :,共軛焦掃描器( 請參考光路圖 ),可見光雷射系統 及 電路控制系
2、統UV 雷射 : 另有獨立的供電開關,雷射電源開關供電電源開關,防震桌,螢光燈源_汞燈,穿透光燈源鹵素燈,顯微鏡總電源開關,反射 / 螢光 及 穿透光光源的切換開關,影像掃描擷取操控旋鈕 ( Control Panel ),Ar/Kr 雷射調整旋鈕,螢光濾鏡轉盤,多光子螢光影像感測用的附加光電倍增管 PMT,穿透光影像感測 PMT ( Phase contrast, DIC ),螢光感測用 PMT( 依組配有 1 4 個 Channel ),K-Scanner,Z-軸掃描,分光鏡,掃描器冷卻裝置,鏡頭瞳孔照明之光徑調控鏡,分光菱鏡,UV 光針孔鏡Pinhole lens,開機流程 :,Step
3、 1,開機注意事項 : 確定電源為 AC220 V. 確定冷氣空調開啟.,UV 雷射電源,可見光雷射系統電源,開機流程 :,Step 2,打開顯微鏡燈源1. 螢光用汞燈2. 穿透光用鹵素燈,按下汞燈開關 置於桌下 / Hg 50 W * 汞燈開關使用間距至少須達 30 分鐘以上 * 汞燈使用壽命一般為 100 小時, 然而, 必須視實際燈管效益而定. 更換時, 請由專人更換調整. 未經許可, 勿擅自動手.,2. 按右邊的顯微鏡總電源開關 ( 左邊為 上下 鹵素燈源的切換開關 / Halogen 12V / 100W ),開機流程 :,7. 啟動 Ar 雷射, 調整旋鈕 轉到 12 點鐘位置,S
4、tep 3,開啟共軛焦供電系統,首先按下 Scanner 鈕,開啟掃描器電源,1,2,3,4,5,6,Scanner_掃描器電源電腦電源Ar 雷射電源He-Ne 雷射 ( Red ) 電源 ( 鑰匙往右扳下 )He-Ne 雷射 ( Yellow ) 電源 ( 鑰匙往右扳下 )啟動 Ar 雷射,鑰匙 往右扳至 Start 位置, 再往左扳回 至中點位置,7,請依序 1 7 按序開機,UV Laser 351 nm/ 364nm (* UV laser 請由專人開啟) Ar Laser 458 nm / 488 nmHe-Ne Laser 543 nm He-Ne Laser 633 nm,檢視樣
5、品,Step 1 : 調焦使用電控升降載物檯, 將樣品移至近焦距處, 用微調旋轉鈕調焦.使用浸漬油時, 不能有氣泡產生.,Step 2 : 光路控制拉桿推入 VIS 位置, 用眼晶觀察樣品,Step 3 :選用適當的螢光濾鏡“ 2 ” = I2 ( FITC )“ 3 “ = N2.( Rodamine ),Step 4 :將 Tube lens 轉到UV-Scan 的位置,Step 5 :聚焦後, 將汞燈柵門關掉, 避免汞燈過度曝晒樣品, 造成螢光漂白,啟動軟體,啟動軟體 ( 以滑鼠點選, 按二下 )電腦會自動起始化,掃描過程中, 請勿觸碰顯微鏡 及 防震桌 !,電腦啟動後, 螢幕會顯示告知
6、, 按下 Ctrl _ Alt _ Del 然後, 不用輸入 Password, 即進入 Windows NT 系統,如果有設密碼 : User : administrator / Password : admin,Start dialog,選取,由於系統啟動後, 掃描器會自動校準, 顯微鏡的 Z-掃描台會自動歸零,而焦距有所位移. 所以, 有時, 必須再看一下顯微鏡下的樣品, 是否有在聚焦位置 ?,A. 顯微鏡觀察及調焦B. 選用螢光感測光譜設定 Acquire Beam C. 設定基本掃描參數 . Obj . Mode . Format . Speed D. 設定 Panel Box 的調
7、控參數 與 配置位置E. 依序執行影像擷取功能 Continuous scan ( 連續掃描 _ 取得最佳調控 ) Single scan ( 單一 2D 影像擷取 ) Series scan ( 連續斷層 3D 影像擷取 )F. 儲存結果 與 進階影像處理, 量測, 編輯, 輸出列印.,啟動軟體之前的注意事項 :,4. 往外拉至 TCS,5. 轉至 “ 4 ” Scanner 的位置,6. 轉至 UV-Scanner 位置 ( 如有 UV-laser 裝置 ),3. 開啟雷射電源, Ar 雷射調整旋鈕 轉到 12 點鐘位置* UV laser 請由專人開啟,如果已完成一般顯微鏡的鏡檢及聚焦,
8、 請依序執下列操作 :,1. 先開 Scanner2. 再開 PC,注意 :請留意每一個小 圖示區 的位置, 因為底下的控制版面是可更改設定與移動的. 所以, 使用人員必須先行清楚每一圖示區的放置位置. ( 未經允許, 請勿擅自更改圖示區的配置 ),圖示區 : Control Button ( 可編輯, 可認意組配安置 .您現在使用中的圖示區安排可能與本圖示配置不同 ),Control Panel 的位置與參數設定,Control Panel 有 7 個對應位置, 針對每一個對應位置, 設定所要使用的控置參數以滑鼠按一下, 即可得到參數選單.,Z-focus,PMT Gain 1/2/3/4,
9、Pinhole,Zoom,檔案管理 ( 存取 ),選取 Acquire . Beam ,選取應用設定設定光路及螢光感測光譜範圍,L : 代表原廠設定無法變更設定U :代表使用者設定可變更設定,如果要自行設定條件及一個專屬應用檔名則, 僅按 SAVE 後, 輸入檔明即可.,參數設定,選取 Glow ( O ),Active表示選用螢光感測 PMT,Active,光譜範圍調整可自行調整光譜範圍或 選用 PMT.,如果應用為 綠色 及 紅色 兩種顯色,雷射激發波長,螢光釋放波長,穿透光影像感測用 PMT,可見光雷射調控 ( AOTF )選用雷射波長調整雷射強度,光路徑,分光鏡,2. 選取所使用中的物
10、鏡 如 PL-APO 63x / 1.32 Oil,1. 選取 XYZ 掃描模式,7. 選取 8 bits,選取 單向掃描 ( Unidirection )如果按下滑鼠, 則為雙向掃描,4. 選取 400 Medium,6. Zoom 選取 1,3. 選 512 x 512,基本掃描參數設定,5. 選 Airy 1,完成上列基本設定後, 即可開始執行連續掃描 ( Continuous scan ),在完成 Acquire Beam 設定後 :,連續掃描 ( Continuous scan ),快速調整 PMT 感測的 gain, 以藍色顯示出現一點點為最佳狀態,調整聚焦, 讓影像清析,此位置應
11、設為 “ Z “ 軸調控.,小小技巧 : 除了 PMT 及 Z-focus 調整外, 也可調整雷射強度, 光譜感測範圍, 或 Pinhole 大小, 或改變 PMT 的 Offset. 如果, 在經過上列的基本調整後, 已可取得不錯的影像, 則可再按一下 Continuous scan , 即可取得影像, 供儲存.如果, 影像仍然有雜訊或不夠銳比, 則可考慮再使用平均 ( average ) 的擷取處理. Averaging 1 64 範圍, 可供選取使用, 供影像擷取的平均化, 以消除雜訊 ( 但, 易光漂白的染劑不適用此法 ),移動掃描中的影像,存取個人 Panel-Box 設定,影像調控
12、 顯示視窗,調控參數即時顯示,如果是取得 series 影像, 可利用此鈕, 播放連續動態影像,按一下滑鼠右鍵, 可更改顯示顏色,1,ch1,ch2,ch3,ch4,如果應用為 3-ch.( FITC / TRITC / Cy5)則第 4 個 ch. 顯示區為 3-ch Overlay 所用,Overlay此為 Index color即是, 依照所選定的顏色來作套色,Mode : 影像擷取掃描模式,Single Scan / 單一影像擷取,選取 ( 可配合 Line average 或 Averaging _ Frame by Frame ),3D series / 連續斷層影像擷取,1. 連
13、續掃描時, 調 Z-焦距, 找出最上點, 在 Begin 按一下, 2. 再找出最下點, 然後在 End 按一下.3. 最後又於 連續掃描框內 ( continuous ) 按一下.4. 再選切片數目, 平均數目, 按 Series 光切掃描.,可配合 Averaging以消除雜訊每一切片的影像要做平均處理嗎 ?,決定光切數目,The Image Tool Window,Tool selection,Operation Buttons,Dialog of the current Tool,Preview,Rotation,Preview快速預覽,Animation,Rotation,Scali
14、ng the z-Axis,Projection & Animation 設定參考, 3D . ImageTool ,The Operation Buttons,Usage (IV),Prev: Compute the result and show it in the Preview WindowApply:Compute the result and transfer it into the ExperimentClose: Close the Image Tool Window,Projection & Animation,Projection & Animation Tool,Sour
15、ce,Parameter division,Current parameter,Maximum projection,Average projection,Transparent projection,Transparent projection (inverted z-Direction),Projection & Animation,x-Axis,y-Axis,z-Axis,Original,z-Rot. = 25,y-Rot. = 120,x-Rot. = 120,Rotation,Projection & Animation,Projection & Animation,Stereo
16、View,Projection & Animation,Stereo Effect,Near Object,Far Object,Stereo Eye Angle,Projection & Animation,Stereo Effect,Images for the left and the right eye,Stereo Image,玻片 : 0.17 mm浸漬油 : r =1.5180Beam : L : FITC Laser : AOTF 調控約至 70% 處Objective : PL-APO 63x/1.32 OilMode : XYZFormat : 512 x 512Speed
17、 : 400 ( medium )Scan : Unidriection ( 不用按滑鼠 )Zoom : 1 ( 原廠起始設定 )Pinhole : Airy 1 ( 原廠起始設定 )Average : 8 ( 原廠起始設定 )PMT 1 gain : 約為 700 左右 顯示 : Glow ( O )Overlay 顯示 : RGBContinuous scan : 取得所欲觀察的聚焦面再按一次 Continuous : 停止掃描如果影像品質及解析可被接受, 請存此影像檔.如果訊號太弱, 或有雜訊, 請執行 Average ( 如取 12 張影像作為平均取像 )執行 Single ( sca
18、n ) 即可取得單一影像.,範例 : 單一螢光影像擷取 ( FITC ),玻片 : 0.17 mm浸漬油 : r =1.5180Beam : L : FITC / TRITCLaser : AOTF 調控約至 70% 處Objective : PL-APO 63x/1.32 OilMode : XYZFormat : 512 x 512Speed : 400 ( medium )Scan : Unidriection ( 不用按滑鼠 )Zoom : 1 ( 原廠起始設定 )Pinhole : Airy 1 ( 原廠起始設定 )Average : 8 ( 原廠起始設定 )PMT 1 / 2 ga
19、in : 約為 700 左右 顯示 : Glow ( O )Overlay 顯示 : RGBContinuous scan再按一次 Continuous : 停止掃描如果影像品質及解析可被接受, 請存此影像檔 ( save as .)如果訊號太弱, 或有雜訊, 請執行 Average ( 如取 12 張影像作為平均取像 )執行 Single ( scan ) 即可取得單一影像.,範例 : 雙重螢光影像擷取 ( FITC / TRITC),FITC,TRITC,Timelapse ( T ) / 長時間掃描記錄在 Mode 選用有 “ T “ 功能的掃描模式才可執行此功能,Time-Series
20、 1/4,Line-Mode xt“Frame-Mode xyt“Stack-Mode xyzt“,Time-Series 2/4,Line-Mode xt“ Configuration,Time-Series 3/4,Stack-Mode xyt“ Configuration,Time-Series 4/4,Stack-Mode xyzt“ Configuration,關機流程 :,首先按下 Scanner 鈕,開啟掃描器電源,5,7,8,2,3,4,1,請依序 1 7 按序關機,1. 關掉 Ar 雷射, 往左調整 旋鈕轉到原點最小處.,6. 結束軟體,注意 :當雷射冷卻至少 15 分鐘後再關掉 8 位置的電源 ( 風扇 ),關掉顯微鏡燈源 ( 汞燈, 鹵素燈 ), 擦鏡頭, 關掉實驗室總開關,
