1、 得分：_南 京 林 业 大 学研究生课程论文2015 20016 学年 第二学期课 程 号：课程名称：论文题目：学科专业： 森林保护学 号： 3150462姓 名： 王立超任课教师： 黄麟二一六 年 六 月内容本文研究松材线虫、松墨天牛和真菌在松树中的共生关系实验材料和方法：（1）真菌小长喙霉在 PDA 平板上、25条件下培养一周，使用前在 5条件下保存。灰葡萄孢在 10 mL 的大麦籽粒上培养。（2）线虫强毒虫株松材线虫 T-4 在 25条件下在灰葡萄孢上培养，使用前在 5条件下保存。松材线虫悬浊液包括成虫和幼虫，悬浊液浓度为 50000 条/mL。（3）昆虫松墨天牛在恒定条件下培养（25
2、，16h 光照、8h 黑暗） ，让其繁殖 10 代，第七代到第十代成虫用来在赤松小苗上产卵，收集天牛所产的卵并将其放置在湿纸巾上，在一天之内孵化的幼虫用于实验。（4）松枝2014 年六月采伐两颗 12 年生（胸径分别为 3.9 和 5.2cm）的赤松和两颗 12 年生的黑松（胸径分别为 8.1 和 9.0cm） ，分别在实验1 和实验 3 中使用。2015 年二月采伐 3 颗 12 年生的赤松用于实验2，胸径分别为 7.4、7.6 和 8.4cm，2014 年十月采伐一颗 12 年生的赤松用于实验 4，其胸径为 6.8cm。树枝截为 15cm 一段，在树枝的两端用石蜡密封起来，每个实验组树枝的
3、树木特定的每组树枝之间不存在显著差异(5)接种使用凿子和镊子在离树端 13.7mm 处从木质部分离树皮（面积22.3mm17.3mm） ，用刻刀在漏出的木质部中间挖一个直径 6-7mm 圆形刻槽用以放置松墨天牛幼虫，一份带有灰葡萄孢或则没有灰葡萄孢的面积为 55mm 的 PDA 培养基放置在远离树端、接近圆形刻槽的位置。用到划长 16.8mm、最大宽度为 14.3mm 的三角形裂口，在漏出的韧皮部接种 20uL 的线虫悬浊液（1000 条线虫）或者是无菌纯净水。两个树皮伤口最小距离平均为 13.7mm，两个伤口接种后覆盖原来的树皮，用封口膜包起来，即使不接种松墨天牛幼虫，也挖一个小刻槽，实验
4、4 中松树枝条不用接种松材线虫悬液或水，不会在树皮上形成倾斜伤口。实验一、为了确定松墨天牛幼虫和小长喙霉对松材线虫种群生长的影响，一组赤松枝条接种松材线虫、松墨天牛和小喙长霉。第二组枝条接种松材线虫、松墨天牛和 PDA，第三组枝条接种松材线虫和小喙长霉，第四组枝条接种松材线虫和 PDA。他们被垂直放置使线虫远离容器底部。25，16h 光照、8h 黑暗，相对湿度 100%条件下常温培养，用纯净水保持湿度。接种 18 天后，从松枝上剥离树皮，从枝条上取幼虫和幼虫粪便，记录韧皮部和木质部上蓝变面积确定小喙长霉的繁殖情况，从纵向韧皮部上剥离四份之一到二分之一的树皮，将树皮外层剥离，收集里面树皮以获得韧
5、皮部样品，再将里层树皮的韧皮部剪切为 1-2mm大小的树皮块，使用一把 15mm 宽的刀片，从接种松墨天牛幼苗和松材线虫的地方包括髓取木质部样品，记录木质部样品真菌繁殖情况，粪便、韧皮部和木质部分别在 25下使用贝尔曼漏斗法分离 48-72h，计算分离线虫浓度，材料在 60下烘 5-12d，称重，线虫密度表示每克材料干重中松材线虫的数量。分别使用电子天平和游标卡尺测量幼虫体重和头壳宽度，分别精确到0.1mg和0.05mm，根据头壳宽度确定幼虫龄期：0.5851.170,1.2601.935, 1.9803.150和3.1504.365 mm分别为一龄、二龄、三龄和四龄虫。实验二、确定赤松中韧皮
6、部、木质部和天牛幼虫蛀屑线虫密度的不同，在 2015 年 2 月 26 日将刚孵化的幼虫、1000 条松材线虫和一份接有小长喙霉的 PDA 接种在 10 条直径相似的上述赤松枝条上，2015 年3 月 26 日分别将韧皮部、木质部和幼虫蛀屑用以分离线虫，确定线虫密度，实验三、确定松材线虫种群和小喙长霉对松墨天牛生长发育的影响，四组黑松枝条接种松材线虫、松墨天牛和小喙长霉三个物种组成的四种组合。方法和实验一方法相同，培养条件相同。每天观察松枝，记录松墨天牛羽化情况，分性别记录成虫数量，体重和鞘翅长分别精确到 0.1mg 和 0.05mm。没有松墨天牛出现的松枝在接种 153-164d 后分离，称
7、量幼虫的鲜重和记录头宽、颜色、肠内排泄物的有无以及幼虫所在的位置。实验四、为确定松墨天牛幼虫对小喙长霉繁殖的影响，6 个赤松枝条接种小喙长霉和松墨天牛幼虫，接种 22d 后，剥离松枝树皮，幼虫蛀屑和幼虫取样，测量幼虫体重和头壳宽度文章结构摘要关键词前言材料与方法真菌线虫传播媒介松树枝条接种方法实验一实验二实验三实验四数据分析结果赤松枝条中松墨天牛幼虫和小喙长霉菌对松材线虫种群的影响（实验一）松墨天牛幼虫的粪便中高密度松材线虫的再现（实验二）黑松枝条中松材线虫和小喙长霉菌对松墨天牛生长发育的影响（实验三）赤松枝条中松墨天牛幼虫对小喙长霉菌的影响（实验四）讨论参考文献设计思路实验一为研究赤松枝条中
8、松墨天牛幼虫和小喙长霉菌对松材线虫种群的影响，实验选取年龄和粗度相似的赤松为材料，分四组实验进行，一组赤松实验材料只接种松材线虫、一组赤松材料接种松材线虫和松墨天牛，一组赤松材料接种松材线虫和小喙长霉菌，最后一组赤松实验材料接种松材线虫、松墨天牛和小喙长霉菌，四组实验之间彼此形成对照，通过测量不同接种组合、不同部位的松材线虫密度和松墨天牛的体重和头宽指标来确定三者之间的相互影响。实验二为研究韧皮部、木质部和天牛幼虫粪便中线虫密度的不同，刚孵化的松墨天牛、松材线虫和小喙长霉菌接种在 10 个粗细相似的赤松枝条上，按照实验一发法在各部位取样，测定松材线虫密度。实验三为研究松材线虫种群和小喙长霉菌对
9、松墨天牛生长发育的影响，在四组黑松实验材料上按照实验一中接种方法接种松材线虫、松墨天牛和小喙长霉菌三个物种的组合。每天观察记录松墨天牛成虫出现情况，测定体重和鞘翅长度指标。在接种后 153-164 天后，解剖没有松墨天牛出现的松树枝条，称量记录活天牛幼虫的头宽、身体颜色、排泄物状态和其在松树枝条内所在的位置。实验四研究松墨天牛对小喙长霉菌影响，6 个赤松枝条接种松墨天牛和小灰长霉菌，24 天后，在接种位置上剥离树皮，从松树枝条上取下幼虫和幼虫粪便，取整个松树枝条四分之一到二分之一的树皮（包括天牛取食过的树皮，不包括石蜡覆盖的树皮）去除外层树皮，韧皮部切成 1-2cm 宽的小块，使用手钻在接种松
10、墨天牛和小喙长霉菌的位置取韧皮部包括髓，松墨天牛粪便、韧皮部和木质部放在聚乙烯袋子里，-20下保存，两天后，在真空状态下冻干。测定麦角固醇含量。结果和结论实验一在接种 18 天后，解剖松树枝条，在树皮下发现 20 只活的天牛幼虫和 4 只死的天牛幼虫，活天牛幼虫包括 1 个一龄幼虫、2 个二龄幼虫和 17 个三龄幼虫，平均体重 99.2mg，平均头壳宽 2.23mm，在幼虫肠道内发现粪便。解剖实验表明在单独接种松材线虫的 11 个松树枝条中有 6 个松树枝条可观察到小喙长霉菌，在接种松材线虫和人松墨天牛的 12 个松树枝条中有 9 个松树枝条可观察到小灰长霉菌，在单独接种小灰长霉菌的所有松树枝
11、条上的木质部和韧皮部均有真菌分布。在未接种松墨天牛幼虫的松树枝条，木质部和韧皮部的分别分离到线虫量为 2.2g 和 2.9g，在接种松墨天牛幼虫的松树枝条上，木质部、韧皮部和粪便中分别分离到 3.6g、3.2g 和 0.29g 松材线虫。平均线虫密度随接种位置、松墨天牛幼虫及真菌的有无而不同，在未接种真菌的松树枝条木质部的松材线虫密度小于其他接种位置的松材线虫密度，小于接种真菌的松树枝条。未接种松墨天牛幼虫的松树枝条线虫密度大于接种松墨天牛幼虫的松树枝条线虫密度。双因素方差分析表明，在接种松墨天牛幼虫的受接种位置和真菌有无影响，但不受接种位置和真菌互作影响，松材线虫密度在粪便中最大，其次为木质
12、部，最小为韧皮部。实验二在接种刚孵化的松墨天牛幼虫的赤松枝条中存在天牛粪便，解剖发现 9 个活的天牛和 1 个死亡的天牛幼虫，活天牛幼虫平均体重为 118.4mg，头壳宽 2.19mm，表明活天牛为三龄幼虫，死亡天牛头壳宽为 1.35mm，说明此为二龄幼虫，解剖实验发现在 10 个松树枝条的韧皮部存和 5 个松树枝条的部分木质部存在真菌。韧皮部、木质部和粪便线虫密度为 5.3g、3.3g 和 0.52g。双因素方差分析表明，线虫密度受接种位置影响，但不受松树枝条影响，松材线虫密度最大为天牛粪便、其次为韧皮部和木质部。实验三在接种幼虫后的 71 天到 167 天期间出现 23 只雌天牛和 30
13、只雄天牛，在接种后 153-164 天后解剖松树枝条发现在木质部蛹室内发现 11 只活天牛幼虫和 9 只死亡天牛幼虫，活天牛幼虫平均体重为982.3mg，头壳宽为 3.89mm，体色为黄白色到黄色，表明他们是四龄幼虫。方差分析表明成虫的体重不受真菌接种实验、线虫接种、性别、树皮面积和彼此之间互作关系影响。方差分析也表明天牛鞘翅长度受真菌和松材线虫互作关系、真菌、松材线虫和树皮面积三者互作关系的影响，但是不受真菌、线虫和树皮面积的影响。雌天牛的鞘翅比雄天牛鞘翅长。鞘翅长度与树皮面积呈负相关关系。方差分析显示接种天牛幼虫后，天牛成虫出现时间不受真菌、线虫、树皮面积和天牛性别以及彼此之间互作关系的影
14、响。实验四在接种 22 天后，在松树枝条发现 6 只活天牛幼虫，平均体重171.2mg，平均头壳宽为 2.4mm，表明他们为三龄幼虫。天牛粪便的麦角固醇含量最大，其次为韧皮部和木质部，方差分析显示三者之间存在极显著差异。创新性指导意义实验过程控制单因素变量，实验测定的指标多样，可以从不同角度反映实验结果，实验分析多样化，实验数据多次筛选，层层分析，增加数据可靠性。不足之处实验中只考虑线虫取食小喙长霉菌，没有考虑线虫取食松树枝条活细胞的实验四研究松墨天牛对小喙长霉菌影响，实验中在 6 个赤松枝条上均接种松墨天牛幼虫和小喙长霉菌，但未在赤松枝条上单独接种小喙长霉菌作为对照。ReferencesAk
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