1、-葡萄糖苷酶的研究综述摘要：-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.20 ) 因在淀粉加工上具有重要作用，其研究多年来一直受到重视。-葡萄糖苷酶广泛存在于动物、植物和微生物体内，它可从非还原末端水解低聚糖和多聚糖的-1,4-葡萄糖苷键，也能作用于淀粉的-1,6-糖苷键，在高葡萄糖苷受体环境中还可催化转糖苷反应。研究表明-葡萄糖苷酶在不同领域的开发和应用都具有很好的经济和社会效益。关键词: 葡萄糖苷酶 淀粉水解 转糖苷反应 研究进展生物技术和酶工程的飞速发展为开发淀粉水解酶提供了技术支持。淀粉水解酶( 包括转化酶) 是一类以淀粉或不同的糖源为底物，根据水解专一性不同，可将淀粉或糖原降解成不同的单糖、低聚糖
2、和水解多糖的水解酶类。同时，有些酶还具有转化功能，通过分子内的转糖苷作用，改变低聚糖的糖苷键链接方式。淀粉酶是生物体内广泛存在的一种水解酶，主要作用于淀粉，如植物体内的淀粉消化、植物根系中淀粉积累、动物体内摄入淀粉的分解、微生物利用碳源等。特别是具有特殊性质和新的应用领域的酶在工业上具有很重要的作用，它们可广泛应用于食品和发酵工业、化学工业以及医学应用等。-葡萄糖苷酶作为淀粉水解酶家族中的重要一员，对它的研究一直受到人们的高度重视，多年来-葡萄糖苷酶在不同领域的应用均产生了很好的经济和社会效益。1、-葡萄糖苷酶的简介-葡萄糖苷酶(EC.3.2.1.20，-Glucosidases) 为淀粉水解
3、酶类中的一种，主要在细胞外起作用。它从多糖的非还原末端水解底物的-葡萄糖苷键，产生-D-葡萄糖，通常把它们归类于水解酶第3类,主要水解二糖、低聚糖、芳香糖苷，能以蔗糖和多聚糖为底物。同时，它还具有转糖苷作用，可将低聚糖中的，-1，4-糖苷键转化成-1，6-糖苷键或其他形式的链接，从而得到非发酵性的低聚异麦芽糖或糖酯、糖肽等。按一级结构可将-葡萄糖苷酶归为水解酶13类的31家族。-葡萄糖苷酶通常按底物专一性分为3个类型。型-葡萄糖苷酶水解芳基葡萄糖苷如对-硝基苯酚-D-葡萄糖吡喃苷(pNPG ) ，且水解速率比低聚麦芽糖快。型-葡萄糖苷酶对麦芽糖具有高活性，而对芳基葡萄糖苷活性低。型-葡萄糖苷酶
4、与型类似，但它水解低聚糖和淀粉的速率基本一样。2、-葡萄糖苷酶来源及分布-葡萄糖苷酶在自然界分布广泛，种类繁多，性质各异，几乎存在于所有生物体内。目前已经进行研究的-葡萄糖苷酶除少数来源于植物和动物外，绝大多数均来自于微生物中。细菌、霉菌及酵母菌等一些菌株能分泌此酶，其中产酶较多的是黑曲霉，市场上销售的-葡萄糖苷酶产品大都为黑曲霉发酵生产所得。3、微生物-葡萄糖苷酶研究现状微生物来源的-葡萄糖苷酶相对分子量一般在50120kDa之间。不同来源的-葡萄糖苷酶的相性质则差异很大。同一种属的微生物，除少数外，它们所产生的-葡萄糖苷酶性质差异也较大。例如，枯草杆菌属的不同-葡萄糖苷酶分子量一般在651
5、20kDa，有些属酸性水解酶，有些属中性水解酶，最适温度各异，底物专一性也不尽相同，有的主要降解直链淀粉、有的水解麦芽糖和低聚麦芽糖、有的具有较宽的底物专一性，可水解多种底物。 不同的嗜热菌产生的-葡萄糖苷酶，分子量差异较大，嗜热温度低的为65，最高可达到 100。3.1枯草杆菌-葡萄糖苷酶1991年Bradley等研究了嗜热枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 和热溶芽孢杆菌(Bacillus caldolyticus) -葡萄糖苷酶。2种酶均具有胞内低聚-1,4-葡萄糖苷酶活性，经薄层分析，它们水解直链低聚麦芽糖产生麦芽糖和葡萄糖，并水解普鲁兰。二者均不水解Pnpg、麦芽糖、
6、异麦芽糖、异麦芽三糖或潘糖。2种酶均由二亚基组成，分子量分别为55kDa和60kDa，最适pH分别为7.5和7.0，对底物p-硝基-D-麦芽糖苷的K m分别为2.96mM和1.31mM。他们在1993年进一步研究了嗜热芽孢枯草杆菌转化株(H-17) -葡萄糖苷酶。此酶为胞内酶，具有水解低聚-1,4-糖苷键活性，也可水解直链麦芽低聚糖产生麦芽糖和葡萄糖，同时还具有普鲁兰酶活性，水解普鲁兰产生麦芽糖、葡萄糖及( 异构) 潘糖。此酶对pNPG、麦芽糖、异麦芽糖、异麦芽三糖、( 异构)潘糖无活性，但对淀粉有轻微的水解作用。原酶为二亚基，亚基分子量为5.5kDa，等电点pI4.8，最适pH7.5,5Mm
7、 Tris溶液可80抑制其活性，对p-硝基苯酚-D麦芽糖苷K m值为1.46Mm，最适酶活力温度65，其嗜热活性需要最低浓度0.02%的巯基乙醇或 0.005Mm的EDTA。氨基酸分析发现H-17株产生的酶与枯草杆菌2S产生的酶相比，前者具有较多数量的疏水氨基酸残基，是酶热稳定性和水解活性增加的原因。3.2 出芽短梗霉菌胞内-葡萄糖苷酶出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulasns)可产胞内-葡萄糖苷酶，1993年Badal等将此酶经Trition X-100溶解、Q-Sephacry处理，羟磷灰石、辛基-琼脂糖柱层析、Sephacryl S -200 (丙烯葡聚糖凝胶) 过滤
8、可纯化124倍，酶活达到316.82 U/mg蛋白。在50时最适Ph4.0，稳定pH范围3.06.0，在60时稳定，最适活力温度为60。部分纯化的酶分解麦芽糖、异麦芽糖、蔗糖和海藻糖，水解相对速率分别为100，60，47，和50，对多聚糖无活性或活性很低，酶活性不需要金属离子参与。3.3芽孢杆菌-葡萄糖苷酶 Takii等研究的嗜热脂肪芽孢杆菌( Bacillus stearothmophilus)ATCC12016-葡萄糖苷酶可从非还原末端专一性水解麦芽糖和-葡聚糖的-1,4-糖苷键。它的核苷酸序列推断为1665个碱基对，由555个残基组成，分子量为6.52kDa。此酶与蜡状芽孢杆菌(Baci
9、llus cereus)ATCC7064、嗜热葡萄糖苷酶地衣芽孢杆菌( Bacillus thermoglucosidasius)KPI006、卡尔斯伯酵母(Saccharomyes carlsbergensis)CBII、枯草杆菌(Bacillus sp.)SAM1606枯草杆菌等的葡萄糖苷酶和变性链球菌(Streptococcus mutans) 的右旋葡萄糖苷酶及大肠杆菌 ( Escherichia coli)ECLII6 的海藻糖6-磷酸水解酶具有40%57% 的序列相似性( 所有这些酶均显示出于蜡状芽孢杆菌( B.cereus) 葡萄糖苷酶相似的X衍射二级结构。他们认为此酶位于N-端
10、的一个活性中心，为(/B)桶状折叠结构。2009 年Arzu 等对地衣芽孢杆菌(Geobacillus sp. )A343和嗜热菌A343的嗜热-葡萄糖苷酶性质进行了研究。他们从地衣芽孢杆菌A343和嗜热菌A343中部分纯化分离出2种嗜热的-葡萄糖苷酶。A343的-葡萄糖苷酶最适温度60、Ph6.8、对pNPG底物的Km值为1.38Mm.A343-葡萄糖苷酶最适温度65、Ph8.5。 通过20种底物专一性和薄层层析分析证明A343-葡萄糖苷酶具有较高的转糖苷活性，而A343-葡萄糖苷酶有较宽的底物专一性。A343-葡萄糖苷酶底物为麦芽糖、糊精、松二糖、麦芽三糖、麦芽戊糖、麦芽四糖、麦芽六糖、苯
11、基葡萄糖吡喃。A343-葡萄糖苷酶更多的水解糊精、松二糖、麦芽糖、苯基葡萄糖吡喃苷、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽戊糖、麦芽六糖、异麦芽糖、蔗糖和曲二糖等的-1,2、-1，3、-1,4、-1,6键。60保温5h，A343 和A333 的活性保留分别为 92 %和83% 。经试验测试它们能抵抗许多变性剂#抑制剂和金属离子2种-葡萄糖苷酶的转糖苷活性和淀粉水解能力均具有潜在的开发价值。3.4 曲霉-葡萄糖苷酶黑曲霉(Aspergillus niger)在以木薯淀粉为碳源的培养基中可产生2种葡萄糖淀粉水解酶: -葡萄糖酶和-淀粉酶。2种酶经硫酸铵沉淀、离子交换层析和2次凝胶过滤层析可纯化为2种纯酶，葡萄糖
12、淀粉酶 1和葡萄糖淀粉酶2，分子量分别为74kDa和96kDa，等电点 pI分别为3.8和3.95，最适 pH则分别为4.2和4.5，稳定pH范围 3.59.0。这2种酶均有嗜热性，最适温度分别为60和65，在60时酶活性可稳定1h。酶动力学分析表明2种酶水解支链淀粉均比直链淀粉更有效，说明2种酶均具有-葡萄糖苷酶的水解活性。3.5 其他微生物的-葡萄糖苷酶疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)在生长过程中可用右旋糖作为碳源，它们在早期的发育过程中能产生一种具有降解右旋糖的-葡萄糖苷酶。酶活高峰期在培养22 h后出现，在菌种培养的稳定期，由于其他蛋白酶的影响，酶的活
13、力极快地降低。此酶是一种高活性的水解葡聚糖苷的-葡萄糖苷酶。4 -葡萄糖苷酶研究发展趋势1982年日本林原生化研究所成功筛选出-葡萄糖苷酶生产菌种，使该酶得以实现工业化规模发酵生产，产品大量应用于淀粉加工业和食品工业。此后，各种新型的-葡萄糖苷酶及其新的应用受到空前的重视。从-葡萄糖苷酶研究的历史进程分析，对它的研究可分为3个方面: 主要集中在生-葡萄糖苷酶的微生物菌种的筛选方面，涉及菌种培养、酶活力提高、酶分离纯化和酶的基本理化性质研究；集中在酶的氨基酸序列分析、酶的结构分析、酶的催化机理研究等; 集中在酶的应用开发，包括酶的水解底物专一性、酶水解底物的条件和速度、酶催化反应产物及应用开发、
14、新型-葡萄糖苷酶开发及应用等。目前，-葡萄糖苷酶已广泛应用于淀粉水解、酒精发酵、低聚异麦芽糖生产、化学合成、代谢机理研究、临床检测和疾病治疗等领域。国外对-葡萄糖苷酶的研究较深入，经文献检索已报道的各类-葡萄糖苷酶研究达几十种，日本、美国、丹麦等国家已实现微生物发酵-葡萄糖苷酶的工业化生产。我国对-葡萄糖苷酶研究还处于起步阶段，主要集中在第一方面的研究，对酶的结构、催化机制、酶应用和酶产品开发等方面的报道很少，更没有工业化-葡萄糖苷酶的产品，研究和生产用酶基本上全部依赖进口。今后我国-葡萄糖苷酶的研究和产品开发任重而道远。参考文献：【1】 淮海工学院.一种热球菌产高温-葡萄糖苷酶及其产酶方法：中国，CN101195818AP.2008-6-11.【2】 杨磊，吕明生.超嗜热菌Thermocccus sp.HJ21产高温-葡萄糖苷酶条件和酶学性质初步研究【J】.食品发酵工业，2008,34（7）：1-6.【3】 中国科学院微生物研究所.一种新的高温-葡萄糖苷酶的基因：中国，CN1500869AP.2004-05-02.【4】 汪东武，王治业，彭章普，等。固定化酵母在蔗糖酒精发酵中的问题探讨J.甘肃科学报，2006,18（1）:64-65.
