1、,外源化学物致癌作用,化学致癌作用(chemical carcinogenesis)是指化学物质引起或诱导正常细胞发生恶性转化并发展成为肿瘤的过程，具有这类作用的化学物质称为化学致癌物(chemical carcinogen)。A carcinogen is an agent whose administration to previously untreated animals leads to a statistically significant increased incidence of neoplasms of one or more histogenetic types as c
2、ompared with the incidence in appropriate untreated animals,人类肿瘤90%与环境因素有关，环境因素包括化学因素、物理因素、生物因素（病毒）等，而其中最主要是化学因素。,8种药品有致癌性：环磷酰胺、氯霉素。美法伦、非那西丁、苯妥英、己烯雌酚、氯甲基酮和萘氮芥,最早见于1775 Pott（英）：扫烟囱工人患阴囊癌；与职业有关，烟灰是直接致癌的因素 19世纪后期的工业革命，导致人工合成化学物的急剧增长。1895 Rehn（德）：染料厂工人职业性膀胱癌；怀疑是化学物引起Ca； 1915 山极和市川（日）：煤焦油涂抹兔耳诱发实验性皮肤癌；192
3、2 Kennway（英）：从煤焦油中分离出多种PAH，其中有几种可诱发动物皮肤癌；证实化学物致癌性； 1945 Case（英）：染料工业膀胱癌流调，证实-萘胺、联苯胺的致癌性；致癌机制未能了解； 20世纪50年代初，DNA双螺旋结构的发现，分子生物学由此获得突破性进展并给研究致癌作用的机制带来广阔前景。尤其在确定致癌作用与DNA损伤和基因突变有关后，提出了一次击中理论，认为只要一次突变就有可能致癌。这与Ames试验的产生有直接关系。 1970年左右，IARC：8090%人类癌症和环境因素有关，其中化学因素约占90%以上。,An overview of primary examples of e
4、vents that have generated important insights into carcinogenesis.,第一节 化学致癌过程,一、细胞癌变的多阶段学说 二、遗传易感性与化学致癌,一、细胞癌变的多阶段学说,致癌的过程:引发(initiation)促长(promotion)进展(progression),组织细胞的病理改变:增生、异型变、良性肿瘤、原位癌发展到浸润癌和转移癌,体外细胞水平上:永生化、分化逆转、转化,多阶段致癌的形态学和生物学特征,在癌变过程中，常积累一系列的基因突变，可涉及不同染色体上多种基因的变化，包括癌基因、抑癌基因、细胞周期调节基因、细胞凋亡基因及
5、维持细胞基因组稳定性的基因。这些基因的激活/失活在时间上有先后顺序，在空间位置上有一定配合,肿瘤发生是指致癌剂诱导细胞的基因突变或表观遗传变异，导致异常增生的单个克隆癌细胞的生成，从而引发致癌过程,促长阶段是单克隆的癌细胞在一种或多种促癌物质的不断作用下，表型发生了改变，恶性肿瘤细胞的各种性状得以表达的过程,促进剂通过刺激细胞增生使引发的细胞发展进入促长阶段，促进剂本身无或仅有极微弱的致癌作用，但反复使用能刺激细胞分裂，形成肿瘤，它们的作用相对短暂，且是可逆的,进展阶段是指由良性肿瘤转变为恶性肿瘤，并进一步演变成更具恶性表型或具有侵袭特征的肿瘤的过程，主要表现是自主性和异质性增加、生长加速、侵
6、袭性加强、出现浸润和转移的恶性生物学特征,微卫星不稳定性(microsatallite instability, MSI)可作为整个基因组中DNA复制错误增多的一种指标，是肿瘤细胞基因不稳定性一项灵敏的生物学标志,二、遗传易感性与化学致癌,基因的遗传多态性的分子基础是单核苷酸多态性(SNP)，SNP指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性,是人类长期进化过程中环境选择的结果，已成为分子遗传标记，是人种之间、个体之间基因功能差异性的遗传基础，也是肿瘤遗传易感性生物学标志。,许多基因的SNP位点与人类肿瘤易感性关系密切,一些相互邻近的多态位点趋向于在一起共同遗传，这些变异连锁的区
7、域就是单体型(haplotype)。,人类基因组单体型图计划(HapMap)通过整合基因组测序成果，从基因组水平检测多个不同族群的SNP位点，绘制人类基因组中独立遗传的DNA“始祖板块”及其SNPs标签的完整目录，从而建立人类遗传的群体信息资源。有助于揭示SNPs与肿瘤发生、发展的关系、探索与肿瘤表型相关的基因型(genotype)或单体型(haplotype)并以之作为分子生物学标志应用于高风险个体的筛查以及肿瘤的预防和治疗,SNP-trait associations detected in GWA studies,第二节 化学致癌机制,一、体细胞突变学说二、非突变致癌机制,化学致癌是多因
8、素、多基因参与的多阶段过程,一、体细胞突变学说,DNA加合物,DNA加合物的形成及持久性反映了生物体暴露于化学物的浓度及时间、生物体对化学物的吸收、代谢以及对DNA损伤的修复能力。因此它既可作为接触标志物，又可作为效应标志物，在肿瘤防治、人群生物监测、毒物危险度评定中有着广泛的应用前景,原癌基因（proto-oncogene）指机体内正常细胞所具有的能致癌的遗传信息.正常情况下它呈静止状态，对细胞无害且具有重要生物学功能。在进化过程中高度保守，在细胞中行使正常的生物学功能，对细胞增殖、分化和信息传递的调控起重要作用。,发生恶性转化的原癌基因即是癌基因,致癌因素,原癌基因,突变,癌基因,细胞癌变
9、,化学物通过诱发基因突变或染色体突变(如缺失、插入、易位、扩增和数目改变)，导致某一关键靶基因的可遗传改变对肿瘤的形成是必需的,癌基因（oncogene）指一类在自然或实验条件下具有诱发恶性转化的潜在基因，是化学致癌物作用的主要靶分子，在细胞癌变过程起着关键作用.一类被激活的基因，所指导合成的蛋白质能够促成细胞恶性表型的形成。,癌基因点突变是导致癌基因活化的主要形式,肿瘤抑癌基因或抗癌基因(anti-oncogen)，是细胞内一类能对抗肿瘤作用的基因。抑癌基因往往在细胞癌变或恶性变的过程发生失活或纯合缺失。通常情况下，抑癌基因在控制细胞生长、增殖等过程起负调控的作用，而在诱导细胞分化及诱导细胞
10、凋亡的过程则发挥正向调节的功能。,肿瘤“两次突变”的假说(two-hit hypothesis),Rb基因编码的蛋白是细胞周期重要的调控因子，通过自身的磷酸化状态，调节转录因子E2F的活性，控制细胞的增殖。,人类肿瘤中50%以上存在p53基因的异常，包括点突变、缺失突变、插入突变、移码突变、基因重排等。 p53参与细胞周期调控、DNA修复、细胞分化、细胞凋亡等过程，在细胞内的核心作用是介导DNA损伤后的应激反应、使细胞阻滞于G1期以修复损伤、维持基因组的稳定性。 突变了的p53失去上述功能，使细胞失去监控进而发生恶性变。,DNA修复与化学致癌,二、非突变致癌机制,表观遗传学(epigeneti
11、cs)是研究从基因演绎为表型的过程和机制的一门新兴的遗传学分支。 表观遗传信息提供何时、何地和如何应用遗传信息的指令，在时空顺序上控制基因的表达，不涉及DNA序列改变但又可以通过细胞分裂遗传给子代细胞。 表观遗传修饰网络：由DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑、非编码RNA等形式组成，能动地调控着具有组织和细胞特异性的基因表达模式。,1.表观遗传调控失常导致肿瘤发生,肿瘤细胞中都发现表观遗传变异的一些共同的特征包括整个基因组的低甲基化、某些抑癌基因和DNA修复基因的高甲基化、以及印记丢失等。,2.细胞异常增生,与正常细胞相比，肿瘤细胞具有超过正常的增生能力。 增生可分为良性增生与异常增生或称恶
12、性增生,慢性炎症的刺激可以诱导局部组织的增生，反复的刺激可使良性增生发展为异常增生，最终导致肿瘤的发生,3.免疫抑制,肿瘤细胞可破坏宿主的免疫功能，以保护肿瘤细胞免受宿主细胞的攻击，使肿瘤细胞能继续生长、扩散，并发生转移，这就是免疫“逃避”。 肿瘤逃逸机体免疫攻击的原因可能与肿瘤抗原的缺陷和抗原调变、MHC抗原的表达异常、肿瘤细胞抗原的“封闭”或“覆盖”、肿瘤抗原的加工、处理和提呈障碍、肿瘤细胞协同刺激分子表达异常、肿瘤细胞的“漏逸”和“免疫刺激”、肿瘤细胞分泌免疫抑制性因子等因素有关 外源化学物可能通过抑制免疫功能促进肿瘤的发生，而启动的癌细胞通过免疫“逃避”躲开机体的免疫攻击,4.内分泌激
13、素失衡,环境内分泌干扰物（endocrine disrupters）与人类肿瘤的发生密切关联,5.过氧化酶体增殖剂激活受体,过氧化酶体 过氧化酶体增殖剂(peroxisome proliferalor) 通过受体介导的模式刺激过氧化酶体的增殖, 在细胞内通过与一种雌激素样核受体过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor-, PPAR-)结合并激活此受体。 PPAR-是一类由配体激活的核转录因子,为核激素受体超家族中的成员, 通过与特异的DNA反应元件作用控制基因表达，在调节脂质代谢、糖代谢等方面起重要的作用。 临床发现许多肿
14、瘤如乳腺癌、结肠癌、胃癌等细胞中有PPAR- 的高表达,第三节 化学致癌相关的分子事件,一、基因突变 二、端粒调控与细胞永生化 三、细胞周期调控紊乱 四、细胞凋亡与肿瘤发生,抑癌基因p53和Rb的失活以及端粒酶的激活是人体细胞获得永生化的必要条件,二、端粒调控与细胞永生化,端粒酶是一种核糖核蛋白酶，由RNA和蛋白质组成，具有逆转录酶的功能，能以自身的RNA为模板合成端粒DNA，维持端粒的长度。 端粒是真核生物染色体末端的特殊结构，人类端粒是由1015Kb重复序列（TTAGGG）组成。端粒长度与有丝分裂次数相关，所以又称细胞的“有丝分裂钟” 。 细胞每分裂一次，端粒就缩短一次，细胞就会衰老；当端
15、粒不能再缩短时，细胞就无法继续分裂从而死亡。而端粒酶可以合成端粒，如果端粒酶活性高，就能维持端粒长度保持相对稳定，从而使细胞获得无限增殖的能力，细胞就难以衰老，甚至产生不死性，这也是引起癌症的重要机理 大多数肿瘤组织中可检测到端粒酶的活性及端粒酶激活可能发生在肿瘤的早期的实验证据有力地证明端粒酶的激活与恶性肿瘤的发生密切相关,三、细胞周期调控紊乱,驱动机制 （细胞能否增殖),监控机制 （能否“忠实”增殖）,细胞周期调控的核心成员是细胞周期素（cyclin），周期素依赖性蛋白激酶(cyclin dependent kinases, CDKs)和CDK的抑制性蛋白(CDK inhibitor, C
16、DKI),细胞周期的基因调控,在化学致癌过程中，外源化学物通过诱导基因突变或表观遗传变异而致癌的过程中，其中一个重要的事件就是细胞周期调控的重要因子功能障碍，增强细胞周期的驱动能力，并使正常的监控能力下降，最后造成细胞周期调控失常，细胞进入失控性生长状态,四、细胞凋亡与肿瘤发生,细胞凋亡(apoptosis)是指细胞在一定的生理或病理条件下，受内在遗传机制的控制自动结束生命的过程，是一种自然的生理过程。它是机体为了清除多余的、有害的、已经完成使命的细胞，维持机体的稳态所启动的系统,细胞凋亡调控异常与肿瘤发生密切相关,一、根据致癌物对人类和动物的致癌作用分类,IARC将化学物对人类致癌性资料(流
17、行病学调查和病例报告)和对实验动物致癌性资料分为四级：致癌性证据充分、致癌性证据有限、致癌性证据不足及证据提示缺乏致癌性。,第四节 化学致癌物的分类,组1，对人类是致癌物。对人类致癌性证据充分者属于本组。 组2，对人类是很可能或可能致癌物。又分为两组，即组2A和组2B。 组2A，对人类很可能(probably)是致癌物，指对人类致癌性证据有限，对实验动物致癌性证据充分。 组2B，对人类是可能(possible)致癌物，指对人类致癌性证据有限，对实验动物致癌性证据并不充分；或指对人类致癌性证据不足，对实验动物致癌性证据充分。 组3，现有的证据不能对人类致癌性进行分类。 组4，人类可能非致癌物。,
18、二、根据化学致癌物作用模式的分类,遗传毒性致癌物 （genotoxic carcinogens）指进入细胞后与DNA共价结合，引起机体遗传物质改变，导致癌变的化学物质。直接致癌物(direct carcinogens)：烷化剂 间接致癌物(indirect carcinogens)：PHA、芳香胺类化合物 无机致癌物：金属Ni、Cr,2.表观遗传毒性致癌物（epigenotoxic carcinogens）指不作用于机体遗传物质的化学致癌物。 1） 促长剂 TPA 2） 内分泌调节剂 如乙烯雌酚、雌二醇、硫脲 3） 免疫抑制剂 如嘌呤类似物 4） 细胞毒剂 5） 过氧化物酶体增殖剂 6） 固态
19、物质 如石棉、塑料3.未分类 二恶烷,第五节 化学致癌物筛查的基本方法,一、定量构效关系分析 二、遗传毒性试验 三、细胞恶性转化试验 四、哺乳动物致癌试验 五、促癌剂的检测 六、转基因或基因敲除动物在致癌物筛查中的应用 七、人群肿瘤流行病学研究,细胞恶性转化试验,指外源因素对体外培养的细胞所诱发的恶性表型改变，包括细胞形态、细胞增殖速度、生长特性(锚着独立性生长或接触抑制消失等)、染色体畸变等变化，当细胞接种在裸鼠皮下可形成肉眼可见的肿瘤,既可以筛查遗传毒性毒物, 也可以检测非遗传毒性毒物,细胞转化试验是体外试验，不能代替整体动物试验,哺乳动物致癌试验,(一) 动物短期致癌试验,小鼠肺肿瘤诱发
20、试验； 雌性SD大鼠乳腺癌诱发试验； 大鼠肝转变灶试验； 小鼠皮肤肿瘤诱发试验。,确认动物致癌物较为可靠的方法 在毒理学安全性评价中是任何其它体外试验所不能替代的 实验结果外推到人存在不肯定性 1 动物选择和动物数量 2 剂量设计 3 试验期限和染毒时间 4 结果的观察、分析与评定:肿瘤发生率、多发性、 潜伏期,(二) 哺乳动物长期致癌试验,转基因或基因敲除动物在致癌物筛查中的应用,通过转基因和基因敲除技术所构建的小鼠模型为研究化学致癌作用提供了新的手段，并为快速检测致癌物提供了新的重要途径 应用于致癌机制研究和致癌物筛查的转基因小鼠模型主要包括抑癌基因敲除小鼠或癌基因高表达小鼠,人群肿瘤流行
21、病学研究,肿瘤流行病学调查是确定人类致癌物的唯一手段 要从肿瘤流行病学调查中得到正确的结论，关键在于严谨的研究设计和研究条件的具备，基本的条件包括有足够量的接触人群、一定的接触史(20年左右)、能推算出接触剂量、对照组选择合理(干扰因素的控制)等等 分子毒理学和流行病学相结合,ICH(1995)根据已知的危险因素、拟定的适应症和用药时间，提出下列进行新药致癌性研究的范围，避免不必要的试验。 临床上连续应用6个月以上的药品；对慢性或复发性疾病需间断性长期反复治疗的药品；造成长期暴露的给药系统。 已知属于对人具有潜在致癌性的同类化合物；构效关系提示具有致癌危险性的物质3长期毒性试验发现癌前病变3原
22、型或代谢产物在组织内长期蓄积，引起局部组织反应或其他病理生理反应的物质。 具有遗传毒性的物质往往具有致癌性，如拟长期使用，应进行慢性毒性试验(1年)，检测早期致癌反应。 拟用于病人预期寿命少于3年的药品不必进行致癌试验，如肿瘤治疗药等。,局部使用吸收很差的药物不必进行经口致癌试验。已具有致癌性资料的药物的各种酸、碱、盐应提供其在药物动力学、药效学或安全性方面没有明显改变的证据，对于酯和复杂的衍生物在确定是否需要进行致癌试验时也应有类似的资料，并应个案讨论。基本作为替代治疗的内源性物质不需要进行致癌试验。但对生物技术制品，下列情况可考虑进行致癌试验：生物学作用明显不同于天然相应物质的制品；结构明显不同于天然相应物质的制品；在人体引起局部或全身浓度明显增加的制品。,
