1、山东中医药大学药学院,第十八章 细胞工程与基因工程育种,植物离体培养的概念与应用: 组织与器官培养: 花药和花粉培养与单倍体育种: 植物细胞培养及其突变体筛选: 原生质体培养与体细胞杂交:,山东中医药大学药学院,植物离体培养的概念与应用,植物离体培养的概念： 植物离体培养的类型： 植物离体培养在药用植物育种中的应用：,Back,山东中医药大学药学院,植物离体培养：即广义的植物组织培养，是指通过无菌操作，将植物的组织、器官、细胞以及原生质体等接种于人工配制的培养基上，在人工控制的环境条件下进行培养，以获得再生的完整植株和生产具有经济价值的其他生物产品的一种技术。是现代生物技术的一个重要组成部分。
2、,Back,山东中医药大学药学院,生物技术（biotechnology、生物工程或生物工艺学)：是指以生命科学为基础，利用生物体系和工程原理创造新品种和生产生物制品的综合性科学技术。,基因工程 细胞工程 酶工程 发酵工程 生物化学工程 蛋白质工程,Back,山东中医药大学药学院,基因工程：就是将生物体的遗传物质（DNA）取出进行体外操作，包括基因的分离、剪切、拼接、组合，然后将其转入寄主细胞，外源基因在寄主细胞内大量复制、表达，从而使寄主具有新的遗传性。基因工程是按照人们的预想重新设计生命。因为是遗传物质的重新组合，所以也叫重组DNA工程,Back,山东中医药大学药学院,细胞工程：是以细胞为基
3、本单位在离体条件下进行培养、繁殖或人为地使细胞某些生物学特性按照人们的意愿发生改变，从而改良生物品种和创造新种，或加速繁育动植物个体或获得有用物质的过程。细胞工程包括的内容有细胞融合技术、组织培养技术、细胞器移植技术和染色体工程技术。,Back,山东中医药大学药学院,酶工程：指利用酶、细胞和细胞器所具有的某些特异催化功能，借助生物反应器和工艺过程来生产人类所需要的产品的一种技术。 发酵工程：指给微生物提供最适宜的生长条件，利用微生物的某种特定的功能，通过现代化工程技术手段生产人类需要的产品。又称微生物工程。,Back,山东中医药大学药学院,生物化学工程：简称生化工程，是由生物科学与化学工程相结
4、合的交叉学科，主要研究将生物技术的实验室研究成果转化为生产力过程中的带有共性的工程技术问题。 蛋白质工程：指利用生物技术手段对蛋白质的DNA编码序列进行有目的的改造并分离、纯化蛋白质，从而获取自然界没有的、具有优良性质或适用于工业生产条件的全新蛋白质的技术。,Back,山东中医药大学药学院,植物离体培养的类型（按外植体的种类和培养目的来分）:,胚胎培养 组织培养 器官培养 花粉培养与花药培养 细胞培养 原生质体培养,Back,山东中医药大学药学院,外植体：在离体条件下，分离下来进行培养的部分称为外植体。,Back,山东中医药大学药学院,植物离体培养在药用植物育种中的应用,扩大变异范围 克服远缘
5、杂交的一些障碍 获得体细胞杂种 倍性控制 突变的诱导和离体选择 加速亲本材料的纯化 快速无性繁殖 获得脱毒苗 种质资源的试管保存 可作为外源基因转化的受体系统,Back,山东中医药大学药学院,组织与器官培养,实验室 无菌操作室 培养室 化学实验室、洗涤消毒室和细胞学实验室 培养条件 步骤与方法,Back,山东中医药大学药学院,培养条件,培养基 无菌操作 培养的环境条件,Back,山东中医药大学药学院,培养基,种类 固体培养基 液体培养基 营养成分 配方：常用的有MS、ER、B5、SH、HE等。 配制 洗涤 母液的配制 配制步骤,Back,山东中医药大学药学院,营养成分,无机成分 大量元素：N、
6、P、K、Ca、Mg、S等。 微量元素：Fe、Na、Mn、B、Zn、Cu、Mo、I 等 有机成分 天然复合物：常用的有椰乳、酵母提取物、水解酪蛋白等，还有番茄汁、黄瓜汁、橙汁、马铃薯汁等。 植物生长调节剂 生长素：常用的有2,4 -D、NAA、IAA、IBA等 细胞分裂素：常用的有6-BA、KT、ZT等 赤霉素：GA3,Back,山东中医药大学药学院,有机成分,能量物质：常用2%3%蔗糖 氨基酸：常用甘氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、精氨酸、酪氨酸、谷氨酸、天冬酰胺等 维生素：常用Vc、VB1、VB6、生物素、烟酸、叶酸、肌醇等。,Back,山东中医药大学药学院,无菌操作,污染来源 培养基及玻璃器皿 无
7、菌操作室、所用器械 外植体 材料的消毒 消毒剂的种类：Ca(Cl0)2、NaClO、H2O2、AgNO3、HgCl2、酒精等 消毒方法：材料修整流水冲洗药剂消毒（常用75%乙醇浸渍30s 0.1%升汞浸泡210min或2%10% NaClO浸泡1030min无菌蒸馏水冲洗35次）,Back,山东中医药大学药学院,培养的环境条件,光照：白色荧光灯，光强10005000Lx，1216hr，用自动定时器控制光照时间 温度：多为252 湿度： 容器内湿度：100% 环境湿度：要求70%80%,Back,山东中医药大学药学院,组织培养的步骤与方法,无菌培养的建立 营养繁殖体的增殖 诱导腋芽的发生 诱导产
8、生不定芽 体细胞胚胎发生 生根 试管苗移栽大田,Back,山东中医药大学药学院,花药和花粉培养与单倍体育种,单倍体在植物育种上的重要性 花药和花粉培养技术 单倍体植株的染色体加倍 自然加倍 人工诱导加倍 从愈伤组织再生二倍体植株,Back,山东中医药大学药学院,单倍体在植物育种上的重要性,单倍体染色体加倍可获得纯合二倍体 有利于远缘杂交新类型的培育和稳定 与诱变育种相结合可加速育种进程 可作为外源基因转化的受体系统,Back,山东中医药大学药学院,花药和花粉培养技术,花药培养 材料的选取 材料灭菌 接种培养 再生单倍体植株 花粉培养: 影响花药及花粉培养的因素,Back,山东中医药大学药学院,
9、花粉培养,花粉的分离 机械分离法 自然散落法 花粉的培养 浅层液体培养法 看护培养法,Back,山东中医药大学药学院,影响花药及花粉培养的因素,供体植株的基因型 培养基 小孢子发育阶段 供体植株的生理状态及培养前的预处理 培养方式,Back,山东中医药大学药学院,植物细胞培养及其突变体筛选,单细胞培养 单离细胞的方法： 单细胞培养方法： 培养细胞的密度及活力测定： 细胞突变体的筛选：,Back,山东中医药大学药学院,单离细胞的方法,物理方法 化学方法 酶法,Back,山东中医药大学药学院,单细胞培养方法,液体浅层培养 微滴培养 平板培养 看护培养 饲喂层培养 条件培养,Back,山东中医药大学
10、药学院,培养细胞的密度及活力测定,起始培养的细胞密度：每毫升培养液104108个细胞 细胞活力测定：染色法 荧光素双醋酸盐（FDA） 酚藏花红 Evans blue(Evans 蓝） 植板率的测定：,Back,山东中医药大学药学院,植板率：每个平板接种细胞总数中形成细胞团的百分率,植板率=每平板形成的细胞团数/每平板接种的细胞总数 100% 每平板接种的细胞总数=每毫升培养液中的细胞数目X该平板细胞培养液的毫升数 每平板形成的细胞团数计数方法 低倍显微镜下直接计算 细胞团显影法,Back,山东中医药大学药学院,细胞突变体的筛选,细胞突变体筛选的一般技术 细胞材料的选择 诱发突变的方法 突变细胞
11、的选择方法 突变性状的遗传基础及其稳定性鉴定 农业上有用性状的突变体离体筛选 对病害的抗性 对土壤障碍的抗耐性 对除草剂的抗性 对温度的抗耐性,Back,山东中医药大学药学院,植物原生质体：是指除去细胞壁的由质膜包裹着的具有生活力的裸细胞。原生质体融合：也称体细胞杂交，指使不同的原生质体相互融合形成杂种细胞，再经过人工培养诱导杂种细胞分化形成植株的过程。,山东中医药大学药学院,原生质体培养与体细胞杂交,原生质体的分离 原生质体的培养 原生质体的融合 原生质体融合体的发育及杂种细胞的筛选 体细胞杂种植株的再生及其鉴定,山东中医药大学药学院,原生质体的分离,分离原生质体的材料来源叶肉组织，无菌苗的
12、子叶，愈伤组织及悬浮细胞最常用。 分离植物原生质体的酶 原生质体分离的操作程序,山东中医药大学药学院,原生质体的培养,原生质体的培养方法 原生质体的分裂与增殖 植株再生,山东中医药大学药学院,原生质体的融合,原生质体融合的类型 诱导融合的方法和步骤,山东中医药大学药学院,胚性愈伤组织,山东中医药大学药学院,纯化后的原生质体,山东中医药大学药学院,基因工程育种,分子育种：运用分子生物学技术，通过直接手段或间接手段选育新品种的途径。基因工程与育种 分子标记辅助育种 ,山东中医药大学药学院,基因工程与育种,基因工程的概念与作用 植物基因工程的方法与步骤 基因工程的安全性评价,Back,山东中医药大学
13、药学院,基因工程的作用,抗病基因工程 抗虫基因工程 抗除草剂基因工程 抗逆境基因工程 提高果实耐贮性和切花寿命基因工程 提高产量和改良品质基因工程,Back,山东中医药大学药学院,植物基因工程的方法与步骤,目的基因的分离和克隆目的（外源）基因的导入转基因植株的鉴定,Back,山东中医药大学药学院,目的基因的分离和克隆,鸟枪法 mRNA分离法 转座子标签法及T-DNA插入突变法 基因图谱的克隆法,Back,山东中医药大学药学院,目的（外源）基因的导入,农杆菌介导的遗传转化 DNA理化转移方法 种质系统转化法 微激光束法 病毒载体法,Back,山东中医药大学药学院,DNA理化转移方法,化学刺激质粒
14、入原生质体 电融合法 微注射 基因枪法 超声波处理法 碳化硅纤维介导DNA转移法 电泳法,Back,山东中医药大学药学院,转基因植株的鉴定,外源基因整合的鉴定 外源基因转录水平的鉴定 外源基因表达蛋白的检测 报告基因的酶法检测,Back,山东中医药大学药学院,基因工程的安全性评价,安全性评价的意义 安全性评价与控制措施 申报与审批制度,Back,山东中医药大学药学院,分子标记辅助育种,分子标记的种类及其原理和方法 RFLP标记 RAPD标记 AFLP标记 SSR标记 分子标记辅助育种的应用,Back,山东中医药大学药学院,分子标记辅助育种的应用,分子标记与育种亲本选择 分子标记与育种过程监测和个体的鉴定 分子标记与品种审定,Back,
