1、电子显微镜技术 在病毒学中的应用,一、概述 二、病毒学研究中所用电镜样本制作 三、临床材料的取样和处理 四、病毒的基础研究,病毒学的发展历程与电镜技术的发展相辅相成，互相促进。,一、概述,电镜技术的发展对病毒学发展起了极大的促进作用。,在研究病毒侵入宿主细胞后，发生了一系列的变化，又推动电镜技术从简单的形态学观察发展到一个动态的示踪过程。,近年来，核酸分子杂交技术，电镜的核酸研究技术进展对病毒的分子生物学研究起了更大的推动作用。,电镜可直接观察 DNA分子与RNA分子外，还可观察到某些蛋白质与核酸相结合时的复合物,二、病毒学研究中所用的电镜样本制作技术,（一） 负染色技术 （二） 琼脂扩散技术
2、 （三） 假复型技术 （四） 病毒颗粒免疫电镜技术 （五） 超薄切片电镜技术(六) 免疫超薄切片电镜技术,（一） 负染色技术,负染色也叫阴性反差染色。Hall（1955）和Huxley（1957）首先采用的这种染色技术。用磷钨酸（PTA）对灌木病毒及烟草花叶病毒进行染色后，观察到前所未见的细微结构。,1、 负染色的原理,负染色技术用重金属染液里的金属原子作为电子“染料”，把密度较低的生物标本（病毒）包绕而形成明显反差的方法。电子光束能够通过低电子密度的病毒颗粒，而不能通过金属背景，从而使病毒颗粒呈现出明亮清晰的结构，即负反差。,在电镜照片上 (与正染色相反) 在黑背景中呈现出“白色”的样品。负
3、染色技术目前在病毒形态和结 构研究中最为成功。,负染色 正染色,阴性反差染色 阳性反差染色 细微结构本身不被 染色剂与细胞微细结构染色结构周围染色 成分相结合 背景被染色 增加标本结构本身密度散射电子的能力强 增加其散射电子能力 样品周围成暗色 细微结构呈黑色结构本身成像浅 未被染色的背景浅淡,2、优点,（1） 负染色技术反差好，分辨率高（可达20Ao左右） （2） 简单易行、快速等优点。,在生物学研究中广泛的应用主要用于细菌、病毒、分离的细胞器、核酸大分子、蛋白质晶体及其他大分子材料等研究，尤其是在病毒学领域。,3. 染色剂：,1）较高密度：染色剂应具有较高的电子密度和较强的电子散射能力，产
4、生足够的反差。 2）溶解度高：优良的染色剂在水中需要有良好的溶解度；染色剂不形成颗粒状结构或析出结晶。 3）熔点较高：在电子束照射下不升华挥发；,4）分子细小，容易在不规则的样品表面渗透到各个细微角落； 5）与样品不发生化学反应；这样才能客观地显示样品的真实形态。凡密度比生物标本大4倍以上的金属溶液均可作为负染色液；在病毒研究中最常使用：1-3%磷钨酸盐水溶液0.1-1%醋酸铀水溶液,4. 负染色方法：,（1）滴染法： 样品悬液滴到有支持膜的铜网上 将染色剂溶液滴到样品上 自然干燥后即可电镜观察,（2）漂浮法,带有支持膜的铜网，在悬液样品的液滴上漂浮 再置于负染液的液滴上漂浮漂浮期间，样品与染
5、液吸附在铜网的支持膜上 待干后电镜观察,（3）喷雾法,样品悬液负染色液 等量混合 特制喷雾器喷到带有支持膜的铜网上 待干后电镜观察优点：雾滴小，样品分布均匀 缺点：消耗较多的样品及染料易使病毒扩散，不常用。,标本染液混合染色法：,病毒悬液和2的磷钨酸染液等量混合 用毛细管滴到有膜的载网上（吸去过多的病毒染液混合物），待干后进行电镜观察。 一般认为病毒浓度在105以上时不难发现病毒。,5. 影响因素：,1）样品的纯度：负染色样品纯度要求不是很高，最好进行适当纯化；样品杂质太多，如大量的细胞碎片、培养基残渣、糖类、各种盐类结晶均会干扰染色效果及电镜观察。2）样品的浓度：被检查的样品要有适当的浓度。
6、太浓 太稀均影响电镜观察。,3）样品与染液的均匀分散度,为促进样品与染料的均匀分散提高染色效果，可以采用某些分散剂4） 悬液与染液的酸碱度一般以中性或略偏酸性（PH 6.47）为宜。5）染色时机的把握吸去过多样品悬液后尽快滴加负染色液,注意：,进行负染色观察样品，应多次重复实验，慎重作结论 应该做必要的对照，以排除某些假象,（二）琼脂扩散技术： 检测的材料中病毒含量不足时，为了达到浓缩病毒的目的，并去除材料中所含盐分，可采用琼脂扩散法。 用0.8%琼脂铺好的琼脂块，把含病毒的悬液滴到琼脂块上，然后把载网倒悬在这滴悬液上。琼脂块把水分吸收，浓缩的病毒沾附在载网上，再经过负染色后进行电镜观察。,（
7、三） 假复型技术：,琼脂或琼脂糖表面上粘附的病毒颗粒，以假复型的形式转移到火棉胶膜上或Formvar膜上。此种方法：能去除标本中的盐分、浓缩病毒；减少不必要的杂质；比较费时。,方法：,1）将20%的琼脂糖块放到载玻片上，滴上含病毒的悬液，将它放到紫外灯下照射消毒，直到悬液被琼脂吸干。 2）在琼脂块的表面加一滴0.5%Formvar溶液，把多余的Formvar用滤纸片吸走。 3）用刀片将琼脂块的边缘切除（为便于剥离）轻轻将载有琼脂块的载玻片浸入PTA或醋酸铀溶液中，并把Formvar膜剥离和漂浮到染液水面上。,4）将铜网放到剥离到水面上的 Formvar膜上。5）用不锈钢小柱把铜网膜同Formv
8、ar膜一起打捞出来，即可进行电镜观察。,（四） 病毒颗粒免疫电镜技术：,病毒颗粒与其外周相伴随的结构成分杂质或人工损伤产物混淆不清。特别是肠道病毒与粪便中成分难以分辨。 这种情况需要借助特异性的抗血清（抗体），把病毒颗粒包被、凝聚起来。 病毒颗粒经过特异性的抗体结合并凝聚成团之后，在负染色下显示出病毒结构，或包被在病毒颗粒表面的抗体，形成抗体桥，这种电镜技术称作免疫电镜技术 （IEM）。,样品制备步骤：,取0.9ml病毒悬液加0.1ml 1：10稀释的恢复期病人血清充分混匀371小时后，置4冰箱过夜然后用琼脂扩散法或假复型法制作电镜标本负染色后，电镜检查,根据抗体凝聚的病毒颗粒的多少和程度以（
9、+）表示 如果检查不到抗体包被的病毒颗粒，可离心，将沉淀重悬浮于1-2滴蒸馏水中，再用同样方法滴膜、负染。 利用免疫电镜技术发现和鉴定了许多重要的病毒。,（五） 超薄切片电镜技术：,负染色电镜技术在病毒快速诊断上应用最广，效力较高。对于活检和尸检所得的组织来说，超薄切片有其独到之处。它不仅可以发现组织和细胞中的病毒颗粒，还可以发现病毒造成的细胞结构病理变化或病毒的有关产物（如包涵体等）。,取材固定脱水浸透包埋超薄切片染色观察此法不及负染方法快速，结果较为可靠，可进行细胞内定位。,(六) 免疫超薄切片电镜技术：,常规电镜固定液对抗原活性有破坏作用，不适于免疫电镜。采用比较温和的固定剂进行超薄切片
10、酶标记免疫电镜或以低浓度的戊二醛、甲醛混合固定液进行免疫胶体金技术,三、临床材料的取样和处理：,用电镜进行诊断， 取材正确与否很重要。 （一）皮肤病损：皮肤的病毒病很多，主要是痘疱、软疣和瘊类例如：单纯疱疹（I型，II型）水痘-带状疱疹传染性软疣（痘病毒科）寻常疣（乳多空科）,取材方便：病损都在皮肤表面或皮肤粘膜交界处，故采样方便。 易于识别： 这些病毒比较大（除乳多空病毒） 具有典型的形态，易于识别。,水疱状病损：吸取疱液，滴在载网上，经负染色后，电镜观察。（直接取材法） 皮肤结痂和疣类病损：取下病损，加少许蒸馏水研磨成悬液，弃细胞碎片，过滤、超速离心，取沉淀染色、电镜观察。（离心提纯法）,
11、（二）粪便：,病毒性腹泻、甲型肝炎、小儿麻痹及许多肠道病毒感染性疾病可以从粪便中排出病毒。 抗体-病毒凝集法 取材原则： 1、发病早期取材，病毒含量较多； 2、取病程中几份大便，发现病毒机会多； 3、收集较多的大便：发现新病毒需深入研究。,标本处理：,粪便用Eagle氏或Hanks液（或生理盐水）制成10%的原液，为了增加病毒含量，将细胞残渣里的病毒全部释放，可用超声波充分振荡后，经离心，取上清液做病毒悬液进行电镜检查。 如果电镜下未发现病毒，可离心，取沉淀滴加蒸馏水重新悬浮，进行琼脂扩散和电镜检查。 如果有恢复期病毒的血清，亦可做免疫电镜检查。,（三）尿液：,经超速离心浓缩尿液； 再进行假复
12、型技术或琼脂扩散等进一步浓缩。 尿中可检查到巨细胞病毒：孕妇 巨细胞病毒可引起胎儿先天畸形。 人乳多空病毒：肿瘤化疗和肾移植病人，由于免疫功能抑制，潜伏的病毒被激发活跃。,（四）血清和脑脊液：,我国乙型肝炎带病毒率可高达12% 电镜在发现乙型肝炎病毒中起了重大作用。 乙型肝炎病毒40-42nm圆形Dane颗粒，20-22nm的小圆形颗粒和管状颗粒都是在电镜下鉴定出来的。 脑脊液中发现病毒机会罕见，电镜不适于进行常规诊断。,（五）鼻咽分泌物,从鼻咽分泌物和洗液中发现呼吸道病毒（流感、副流感、呼吸道细胞融合病毒、冠状病毒等）是可能的,其中尤以冠状病毒较易发现。 用电镜检查鼻咽分泌物中的病毒，效果较
13、差，必要性不大。,四、病毒的基础研究：,(一)病毒形态结构研究： 电镜技术 X线衍射技术 在病毒结构研究中起重要作用 物理化学技术 / 病毒的形态研究则以电镜技术最为重要。 烟草花叶病毒是最早进行电镜观察的一种病毒。Kausche等（1939）首次用电镜证明烟草花叶病毒是一种棒状颗粒，并测出它的近似大小，但图象极不清晰。,50年代末，由于高分辨率电镜的出现、 负染色制样技术的建立，使电镜成为目前研究病毒形态的一个重要的工具。 电镜观察不仅可以区别各种病毒的形态，而且还可以分辨病毒蛋白质外壳的亚基是如何有序的排列。,1、病毒的基本结构,病毒由核酸和蛋白质衣壳构成核衣壳 某些病毒的核衣壳外面还有一
14、囊膜 核酸： 病毒只含有一种核酸 DNA或RNA，可以是单股 或 双股。 衣壳：由大量的衣壳子粒组成的。 衣壳有两种对称形式：二十面体对称螺旋对称,囊膜：囊膜含有脂质双层和 具有特殊功能的蛋白质。 囊膜蛋白有两种：,1） 糖蛋白：暴露在病毒体外表面，有一个糖基化的亲水末端和一个保持在脂质双层中的疏水末端2） 基质蛋白：电镜下可见病毒体外表面的糖蛋白是穗状突起。,2、病毒形态,1）螺旋对称的棒状病毒 2）二十面体对称球状病毒 3）复合型病毒 裸露的螺旋对称型：烟草花叶病毒 有包膜的螺旋对称型：粘病毒 裸露的二十面体立体对称型：腺病毒、呼肠病毒、乳多空病毒 有包膜的二十面体立体对称型：疱疹病毒、白
15、血病病毒 复合型：痘病毒、噬菌体,棒状病毒：,烟草花叶病毒是棒状病毒的代表。 弹状病毒或正粘和付粘病毒的核衣壳也是螺旋对称。 无囊膜的病毒之螺旋对称衣壳非常紧密;有囊膜的病毒之螺旋对称衣壳则较柔和，以便能盘绕在囊膜中。 电镜照相可见到螺旋对称衣壳的旋转螺旋结构。,球状病毒：,是一类分布范围最广的病毒，包括小DNA病毒、乳多空病毒、小RNA病毒、呼肠孤病毒。 所谓球状病毒实际具有二十面体对称。蛋白质亚基组成的球状衣壳。根据立方对称的原则，二十面体应有5，3，2三种对称形式。 二十面体对称衣壳：蛋白质单体形成衣壳子粒结构。衣壳子粒在电子显微镜照相中可见。,复合型病毒,痘病毒：病毒体成砖形或卵圆形
16、噬菌体：大肠杆菌T2、T4、T6或噬菌体，均有非常复杂的结构，包括一个头部和一个尾部。它们有双对称结构，某些成分具有二十面体对称，而有些成分是螺旋对称结构。,4、电镜下病毒鉴别的主要依据,（1）衣壳的对称性：病毒的基本结构：由 DNA或RNA构成的核心 、蛋白质构成的衣壳。大多数病毒的衣壳属于立体对称型，只有少数病毒，如正粘液病毒，副粘液病毒的衣壳是螺旋对称型（2）核衣壳在细胞内装配的部位：DNA病毒（除个别的例外），大多在宿主细胞核内装配；RNA病毒多在胞浆内装配。,（3）囊膜的有无： 有些病毒颗粒衣壳之外还有一层囊膜包裹。 囊膜形成的部位也不尽相同。（4）病毒颗粒的大小： 病毒颗粒的大小对鉴别病毒非常重要。 不能进行培养的病毒，通过电镜来发现 病毒，诊断病毒更有意义。,（二）病毒核酸的研究：,1、DNA和RNA分子的直接观察 电子显微镜能直接看到DNA或RNA 识别核酸是线状还是环状结构 直接了解核酸分子结构 测量核酸分子长度2、RNA分子二级结构的研究,3、核酸与蛋白质复合物的分析了解蛋白质与核酸的关系4、核酸变性图谱分析D环分析、R环分析,5、病毒核酸的异质双链研究；核酸变性、核酸杂交分析 对不同核酸分子之间的关系 有无相似片段做直观了解,
