1、1.载体的定义？载体：指携带外源基因进入受体细胞的运载工具，它的本质是 DNA 复制子。2.载体必须具备的 3 个基本条件?载体的碱基对越多越好？（1 ） 基本条件： 1 具有复制子，能在宿主细胞内自主复制，并携带重组 DNA 分子一同扩增； 2 具有单一限制性内切酶的酶切位点或多克隆位点；3 有合适的选择标记基因，用来筛选重 组 DNA。（2 ） 载体的碱基对越少越好，能够更好的控制目的基因3.目前研究最深，使用最多的载体有？目前研究最深、使用最多的载体是经过改造的质粒载体和噬菌体载体。4.按功能分，有哪些载体？克隆载体的概念？表达载体的概念？（1）按功能分，可分为克隆载体、表达载体、测序载
2、体、转化载体、穿梭载体、多功能载体等。 （2）克隆载体：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质的产物。 （3）表达载体：在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、PBS 、终止子） ，使目的基因能够表达的载体。5.选择标记有哪些？插入失活、a-互补是什么意思？（1）选择标记有插入失活和 a-互补（2）插入失活:若把外源 DNA 片段插入到载体的选择标记基因中而使基因失活，丧失其原有的表性特征。 （3）a- 互补：单独存在的 a 及 w片段均无 半乳糖苷酶活性，只有宿主细胞与克隆载体同时共表达两片段时，宿主细胞内才有 半乳糖苷酶活性，使特异性作用物变为蓝色化合物。6.列
3、举常用的质粒载体名称？PBR322 质粒、PUC 载体、TA 克隆载体7.噬菌体的溶原状态是指？噬菌体感染大肠杆菌时，可能进入一个溶菌循环，结果导致细胞的裂解，释放出噬菌体颗 粒；或者进入与宿主不同程度的稳定状态。8.噬菌体 DNA 由哪三个部分组成？目的基因插入哪个部分？（1）噬菌体 DNA 由左臂、中臂、右臂三部分组成。 （2）目的基因插入中臂（非必须区）部分。9.超级载体的特点？有哪些超级载体？1）超级载体的特点：运载量大（2)超级载体：YACs、BACs10.表达载体与克隆载体有什么最大的区别？表达载体有强大的启动子和 SD 序列，而克隆载体没有11.限制性内切酶限制性内切酶：能识别
4、DNA 分子上的特定位点并将双链 DNA 切断的酶12.DNA 连接酶，T4 连接酶DNA 连接酶：一种能够在两条 DNA 链之间催化 5-P 和 3-OH 形成磷酸二酯键的酶T 4 连接酶：连接黏性末端或平末端的酶13.DNA 聚合酶，Taq 聚合酶DNA 聚合酶：催化脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）聚合成 DNA 的酶Taq 聚合酶：从嗜热水生菌中分离纯化出来的 14.逆转录酶逆转录酶：又称依赖于 RNA 的 DNA 聚合酶，是分子生物学中最重要的核酸酶之一。15.核酸酶， DNase,Rnase核酸酶：通过切割相邻两个核糖酸残基之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子发生水解断裂的蛋白酶DNa
5、se:即脱氧核糖核酸酶，特异水解断裂 DNA 分子的酶RNase:即核糖核酸酶，专门水解断裂 RNA 分子的酶16.碱性磷酸酶，细菌性/小牛肠碱性磷酸酶碱性磷酸酶：有两种不同来源的碱性磷酸酶：一种是从大肠杆菌中纯化出来的，叫做细菌碱性磷酸酶；一种是从小牛肠中纯化出来的，叫做小牛肠碱性磷酸酶。它们能催化核酸分子脱掉 5磷酸基团，从而使 DNA 或 RNA 片段的 5-P 末端转换成 5-OH 末端。细菌碱性磷酸酶：一种是从大肠杆菌中纯化出来的，叫做细菌碱性磷酸酶小牛肠碱性磷酸酶：一种是从小牛肠中纯化出来的，叫做小牛肠碱性磷酸酶17.DNA 与基因的区别？基因是有遗传功能的 DNA 片段18.DN
6、A 的链是通过什么方式连接的？两条 DNA 单链是通过什么键连接在一起的？（1）磷酸二酯键；（2）氢键19.DNA 中四种碱基对的名称？A（腺嘌呤） 、G（鸟嘌呤） 、C（胞嘧啶） 、T(胸腺嘧啶）20.DNA 和 RNA 的区别？（1）DNA 是脱氧核酸； RNA 是核糖核酸；（2）这两种核糖的区别在于脱氧核糖 2-碳原子上的羟基被脱了氧，只剩下 H，这个区别使得 DNA 比 RNA 更具有化学稳定性21.遗传信息是如何表达（翻译、传递）的？P1822.mRNA,tRNA,rRNA 的功能分别是什么？mRNA 功能：信使tRNA 功能：转运rRNA 功能：仓库23.基因突变有哪几种类型？染色
7、体突变，特点突变24.操纵子的概念？概念：在细菌中，一组基因受一个启动子控制，被转录成一个长的 RNA 分子，这样的一组基因成为操纵子。25.简述乳糖操纵子的作用机理？26.增强子的概念？沉默子的概念？增强子的概念：能强化转录起始的一段 DNA 序列为增强子或强化子沉默子的概念：也称为沉默子元件，能够同反式因子结合从而阻断增强子及反式激活因子的作用，并最终抑制该基因的转录活性。27.真核生物，原核生物，病毒的基因组特点？真核生物基因组的特点：1 基因组通常比较大 2）含有内含子序列 3）有大量重复序列 4）表达调控较复杂原核生物基因组的特定：1)染色体不与组蛋白结合 2)不同生活习性下原核生物
8、基因组大小与 GC 含量有关病毒基因组的特点：1）种类单一 2）单倍数基因组，每个基因在病毒中只出现一次3）形式多样 4）大小不一 5）基因重叠 6）动物、细菌病毒与真核、原核基因相似，内含子 7）具有不规则的结构基因 8）基因编码区无间隔，通过宿主及病毒本身酶切 9）无帽状结构 10）结构基因没有翻译起始序列28.基因操作基本步骤？基本步骤：扩、切、接、转、增、检29.目的 基因分离有哪些方法？分别有什么样的特点？分离方法：1）鸟枪法 2）反转录法 3）人工合成法特点 1）鸟枪法：操作简单，广泛使用，工作量大，盲目有时并非一个基因2）反转录法：专一性强，操作过程麻烦，mRNA 很不稳定要求的
9、技术条件高3）人工合成法：专一性强，仅限于合成核苷酸对较少的简单基因30.PCR 技术的目的是什么？操作的步骤和各步骤中发生的反应分别是什么？PCR 技术的目的是：能将待扩目的基因扩增放大几百万倍操作步骤：循环变性退火延伸反应：循环变形：通过加热使模版 DNA 完全变性成为单链同时引物自身和引物之间存在 的局部双链也得以消除退火：将温度下降至适宜温度，使引物与模版 DNA 退火结合延伸：将温度升高，热稳定后 DNA 聚合酶以 dNTP 为底物催化合成新的 DNA 链31.基因操作的理想载体是什么？理想载体：质粒、噬菌体、柯斯质粒32.DNA/RNA 提取过程中有哪些注意事项?DNA 提取注意事
10、项：1)DNA 样品不纯 2)DNA 降解 3)DNA 提取量RNA 提取注意事项：1）RNA 样品不纯 2）RNA 得率低 3）RNA 容易降解33.什么原因导致其不纯？对策？34.什么原因导致得率低？对策？ P80 8435.什么原因导致降解？对策？36.简述常见的核酸检测方法？1）紫外光谱分析法 2）荧光分光光度法 3）凝胶电泳法37.纯 DNA 的 00260/280？纯 RNA 的 00260/280？纯 DNA 的 OD260/OD280 应大于 1.8纯 RNA 的 OD260/OD280 应达到 2.038.荧光分光光度法的特点？灵敏度高 2）信息多 3）专一性强39.凝胶电泳
11、法的大致机理？机理：带电颗粒在电场作用下，向着与其电荷相反的电极移动40.影响核酸保存的关键因素？1、保存液的酸碱度 2、保存湿度41.提纯的核酸如何保存？固态核酸通常在 0以上低温干燥保存即可。小分子核酸保存温度还可以更低一些。液态核酸室温容易变性，短期最好低温（4 摄氏度）保存。42.遗传物质提取过程中有哪些常见的缓冲溶液？EDTA Tris-Hcl TAE TBE TE43.核酸提取的两个原则？1.应保证核酸一级结构的完整性 2.排除其他分子的污染44.核酸提取应注意哪些问题？P80 8445.核酸提取的基本步骤？破碎、提取、纯化46.常见细胞的裂解方式？1、物理法 超声波、研磨法或匀浆
12、法 2、化学法 EDTA 或 SDS 3、酶解法47.常见样本的提取方法？1.浓盐法 2.有机溶剂抽取法 3.密度梯度离心法48.吸附材料结合有哪些常用的介质？硅质材料，阴离子交换树脂，磁珠49.去除 DNA 中的 RNA 用什么酶？去除 RNA 中的 DNA 用什么酶？去除蛋白质用什么酶？RNase DNase 蛋白酶 K50.核酸提取过程中有一步叫酚-氯仿处理的过程，酚、氯仿、异戊醇的作用分别是什么？酚：蛋白质变性剂氯仿：分离更彻底异戊醇：消泡剂51.为什么碱变性是可以从细菌中提取质粒？细胞基因 DNA 是线性的，把 ph 升至 12，氢键会断裂，基因组会变成线性从而可以分开，质粒相对基因
13、组 DNA 要牢固，不容易破裂，仍然保持超螺旋，尽管高 ph 打断氢键，两个环形链也不能分开。52.电泳的定义/概念/带电颗粒在电场的作用下，向着与其电荷相反的电极移动，称为电泳53.电泳的基本原理（分离样品为什么在电泳里迁移速度不一样）？带电性质、分子大小、形状等不同54.影响电泳分离的主要因素（外因）有哪些？1、电压 2、ph 缓冲液 3、离子强度适量 0.02-0.2 4、电渗 5、介质筛孔大小 6、缓冲液的黏度55.琼脂糖电泳中的琼脂糖是什么？低熔点琼脂糖有什么用途？琼脂糖电泳的孔径是由什么决定的？琼脂糖电泳尤其适用于什么？如何检测（用什么染色，染色原理）琼脂糖主要是从海洋植物琼脂中提
14、取出来的线性多，一般含有多糖、蛋白质和盐等杂质。低熔点琼脂糖主要应用于染色体 DNA 琼脂糖内包埋后原位进行内切酶酶切、DNA 片段回收以及小 DNA 片段的分离。琼脂糖浓度适用于分离、鉴定和纯化 DNA 片段。用 EB 染色，在紫外灯下，凝胶中 1ngDNA 即能直接观察到。(EB 染色 键多，易吸收紫外光显色。 ）56.简述琼脂糖电泳的操作步骤？P12557.分子量相当的情况下，线性 DNA、共价闭环 DNA、开环的双链 DNA 迁移速度顺序是？共价闭合 DNA线性 DNA开环的双链 DNA58.聚丙烯酰胺凝胶电泳介质孔径由什么决定？通过改变丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺的浓度比例决定59.聚丙
15、烯酰胺凝胶电泳与琼脂糖凝胶电泳相比哪个分辨率更高？为什么?聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳具有分子筛效应，又具备静电效应。60.聚丙烯酰胺凝胶电泳为什么要用双层玻璃板灌胶？封闭的双层玻璃平板的夹层中灌胶，仅有顶层的部分凝胶与空气中的氧气接触，从而大大的降低了氧对聚合的抑制作用。61.PCR 技术的中文名？目的？原理？请简述答:PCR 即聚合酶链式反应。目的:通过重复循环变性、退火、延伸三个基本反应将所需目的基因在体外成千上百万倍的扩增。原理:模板 DNA 通过加热至 95使 DNA 双链解离，使之形成单链，退火至温度为 55-60引物与单链结合，最后升温至 72DNA 模板-引物结合物在
16、 TaqDNA 聚合酶的作用下进行延伸,重复上述步骤,25-35 个循环就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。62.PCR 过程中需要哪些试剂？分别的作用是什么？答:TaqDNA 聚合酶；促进模板 DNA 与引物结合。引物；与模板 DNA 结合，是决定 PCR特异性的关键。dNTP；在 PCR 反应中起原料作用。缓冲液 (Tris-HCL)；调节 pH。模板DNA、Mg 2+；DNA 酶激活剂 。KCL；使引物与模板更易配对。液体石蜡；防止水分蒸发 63.PCR 过程是否需要解旋酶？为什么？答:不需要。DNA 双链在加热至 95会自动解离为单链。64.PCR 三个环节的温度分别是多少？每个环节的
17、目的是什么？答:变性 :95，是模板 DNA 变性解链；退火:45-65，引物与模板 DNA 单链互补序列配对结合；延伸:72，结合物在 taqDNA 聚合酶的作用下合成新的模板 DNA 链互补的半保留复制链。65.PCR 是否可以无限多次循环？若不能，一般是几个循环?为什么？答:不可以。一般为 25-35 次，因为次数过多 taqDNA 聚合酶活性下降、引物及 dNTP 浓度下降、容易发生错配，导致非特异性产物增加。且产物浓度会随着循环的增加而升高，导致自身相结合而不与引物结合，或产物链缠结在一起，导致扩增效果降低。66.引物的设计需要哪些注意事项？.答:1. 引物不能过长，一般为 18-3
18、0BP。2.引物不能形成发夹结构。3.G/C 或 A/T 碱基应均匀分布。4.不能形成引物二聚体或发夹结构。5.引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。6.引物需与模板 DNA 匹配。67.请举例两种 PCR 技术的名称，并简述大致机理答:1. 反转录 PCR:mRNA 在反转录酶的作用下反转录为 CDNA,以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增,引物与 cDNA 第一链退火,在 taqDNA 聚合酶作用下合成 cDNA 第二链.再以 cDNA 第一链和第二链为模板,反复循环获得大量的 cDNA。2.巢式 PCR:由两对引物所组成，外引物扩增产物较长，含有内引物的靶序列，经过两次PCR 放大，获
19、得目的 DNA 片段。即先用外引物与目的 DNA 进行扩增，然后取少量的第一次扩增产物为模板与内引物进行第二次扩增，第二次 PCR 引物与第一次反应产物的序列互补，第二次 PCR 扩增的产物就是目的产物。68.PCR 技术有什么应用？请举例答: 遗传病诊断、性别鉴定、转基因检测、疾病诊断。69.基因操作的基本步骤是？答:1. 用 PCR 或人工合成的方法扩增目的基因。扩2.用限制性内切酶将目的基因与载体切开。切3.将目的基因与运载体结合。接4.将重组 DNA 引入受体细胞。转5.培养转化细胞，使其大量扩增。增6.筛选含有重组 DNA 分子的受体细胞。检70.ECORL 限制酶能识别的切点碱基序
20、列是？这样的末端叫？答:。GAATTC/CTTAAG 粘性末端71.粘性末端和平末端的区别？末端连接用什么酶？答:用限制性内切酶切割后得到末端齐平的为平末端(TGG/CCA)末端不齐平的为粘性末端(GAATTC/CTTAAG)。 ACC/GGTT4DNA 链接酶。72.如何避免基因重组中载体的自身环化？答:用细菌性或小牛肠碱性磷酸酶预先处理线性的载体 DNA 分子，移去其 5末端的磷酸基团。73.同聚物加尾法？人工接头连接法？答:同聚物加尾法: 在目的基因和载体两端各加入相同的碱基，使其形成粘性末端，在DNA 连接酶的作用下连接。人工接头连接法:将待克隆的 DNA 与衔接物通过 T4DNA 连
21、接酶连接，形成粘性末端，然后用限制性内切酶切割具有衔接物的 DNA 分子和克隆载体分子，使两者都能产生可以配对的粘性末端，将待克隆的 DNA 片段与载体进行连接的方法。74.PCR 操作中 taq 聚合酶在 DNA 链的 3末端加入一个什么碱基？答:碱基 T(胸腺嘧啶)75.将外源重组分子导入受体细胞的途径有哪些？答:转化、转导、显微注射、电穿孔。76.转化和转染有何区别？答:转化为感受态大肠杆菌捕获和表达质粒载体 DNA 分子的生命过程。转染为感受态大肠杆菌捕获和表达噬菌体 DNA 分子的生命过程。77.转化因子和转化子有何区别？答:转化因子为接了 DNA 的质粒。转化子为转化因子接入到宿主细胞内发生的现象。78.外源目的基因向真核细胞转入有哪些方法？答:一、借助载体的基因转移。二、不需载体的基因转移:1.磷酸钙转染法 2、DEAE-葡聚糖转染法 3.聚阳离子-DMSO 转染法 4.显微注射转基因技术 5.电穿孔 DNA 转移技术79.重组子筛选和鉴定有哪些方法？答:1. 遗传学检测法 2.核酸分子杂交检测法 3.物理检测法(凝胶电泳法、R-环检测法)4免疫学检测法(放射性抗体检测法、免疫沉淀检测法 )
