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类型PCR实验室发生污染后处理方法.doc

  • 上传人:精品资料
  • 文档编号:11257475
  • 上传时间:2020-03-05
  • 格式:DOC
  • 页数:3
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    PCR实验室发生污染后处理方法.doc
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    1、PCR 实验室发生污染后处理方法1、确定污染类型1、PCR 实验室发生污染后主要表现为:1 )所有同批次标本及阴阳对照全部为阳性;2)阴阳对照正常,所有标本检测均为阳性;3)除了 CT 值靠前的标本其余标本及阴性对照 CT 值接近临界值,都有微弱翘尾。出现以上三种情况,均可判为发生污染。PCR 污染类型分为样本污染和产物污染。所谓样本污染一般发生在操作 2 区,由使用被污染的耗材和样本交叉污染产生;产物污染有 PCR 扩增产物引起,一般发生在扩增分析区,即 3 区,由于 PCR 反应体系没有完全闭合或者扩增后的体系没有及时安全清理引起。2、确认污染类型才能有效清除污染。发生污染后,更换所有一次

    2、性耗材即移液枪及使用新拆分试剂。有两种简易方法如下:1)不加内标重复实验,检测结果如果内标没有扩增,可判为样本污染,反之为产物污染。2)分 A 和 B 两组,A 组在上机前,八联管开盖在 2 区放置 10min 左右,B 组闭合八联管直接上机。检测结果中若 A 组发生污染 B 组正常,则为气溶胶污染。气溶胶污染有两个来源,其一为扩增产物引起,其二为浓度较高的标本在制备过程中外释累积形成。2、污染处理措施一般而言,发生产物形成的气溶胶污染是很难在短时间内及时清理掉的,这是由 PCR 反应的特点决定的,及其微小的污染物都可以作为模板扩增,释放出巨大荧光信号。因此,很多试剂厂商都有相应的防污染试剂产

    3、品,可以有效防止产物污染,其原理为 UNG 酶对产物核酸片段的有效降解,而不影响我们从标本制备来的核酸模板。但是,彻底消除污染,降低对 UNG 酶的依赖,还需要一套消除污染的体系来应对。具体如下:1、 全面规范操作:1) 进行 PCR 操作时,工作人员应该严格遵守 SOP 操作规程。2) 试剂准备、标本制备区、PCR 扩增区及分析区设计要合理,要有一定的方向性。工作人员要谨循由试剂准备标本制备PCR 扩增区及分析区的工作流程。3) 任何一间的产物及器材不要拿到其它两个工作区。特别要提醒的是各区要有独立的打扫工具,切记不可窜用。如有专门的打扫人员,因对其进行相关知识的培训。4) 使用一次性吸头,

    4、吸头不要长时间曝露于空气中,避免气溶胶污染。5) 操作多份样品时,制备反应混合液,先将 dNTP、缓冲液、引物和酶混合好,然后分装,这样既可以减少操作,避免污染,又可以增加反应的精确度。PCR 试剂,PCR 反应液应与样品及 PCR 产物分开保存,不应放于同一冰盒或同一冰箱。6) 最后加入反应模板,加入后盖紧反应管。7) 要轻拿轻放,开盖要轻,尽量避免气溶胶污的产生。8) 每次实验完后,扩增产物都要及时密封后处理。9) 每次做完实验,要养成对生物安全柜和超净工作台进行消毒的好习惯。2、 PCR 实验室污染全面清理污染发生后,需要对实验室各个部位、大型器材及角落进行彻底清理。具体如下:1) 通风

    5、处理:以上是最高标准的 PCR 实验室,其风向设置能有效避免不同区域空气流动,防止整个 PCR 实验室污染。但是一旦发生气溶胶污染,也不可避免的使得各个区都产生气溶胶污染,这也是由于 PCR 的敏感性决定的。针对气溶胶污染,最有效的是通风处理,即打开 PCR 实验室与外界空气的流通,从而快速使得污染区域的气溶胶被有效稀释。2) 实验室垃圾处理使用过的废弃枪头、EP 管等一次性耗材及时封闭处理掉,不能较长时间滞留废液桶和垃圾桶。另外废液桶使用前,灌入一定量的 84 消毒液或者次氯酸溶液。3) 擦拭使用浸泡过 84 消毒液或者次氯酸溶液的干净桌布或者毛巾对超净工作台、实验桌面、离心机、移液枪等进行全面擦拭,对各区地面使用浸泡过的各区专用的拖把进行全面清理。4) 紫外消毒核酸片段在强紫外光下极易降解变质,达到无法作为模板扩增的目的。擦拭结束后,对实验室各个区域长时间或者过夜紫外照射。5) 空气处理除了通风和紫外处理,可以使用纯水或者制成喷雾对实验室密集喷洒,能有效将空气中的污染物带到地面,然后执行擦拭和紫外照射处理。以上为污染发生后实验室污染清理的基本过程,需要注意的是清理过程要每天执行,直到检测显示污染彻底清除为止。

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