1、谢沐风上海市药品检验所请大家将手机调至“振动”档！谢谢您的配合！感谢国家药监局培训中心给我这样一个与众位同仁相互交流、学习的机会此次讲习班交流的内容化学药物原料药质量研究（例如杂质、残留溶剂研究）化学药物原料药质量控制分析方法验证的技术要求与案例分析化学药物原料药稳定性研究化学药物原料药质量标准建立的技术要求与案例分析（如何拟定质量标准）自我介绍毕业后至今在上海市药品检验所化学室工作经历了“1998年2002年的强仿期”和“20032006仿制药疯狂期”2003年8月 2004年2月赴日本国立医药品食品卫生研究所药品部（相当于我国的中检所化药室）进修2008年11月 2009年1月借调至中检所
2、起草2010年版药典溶出度试验指导原则（新增）日常致力事宜发表了30多篇方法类、思路类文章(1) 如何建立HPLC(TLC)法测定有关物质；(2) 如何建立HPLC法测定含量；(3) 方法学验证的深入剖析；(4) 溶出度研究系列文章每日回复来自全国业内人士的来电来信至少在半小时以上。接触过约1000个品种的检验与质量分析。本人体会工作中一定要注重思考，带着问题去学习、有的放矢地去攻读，多观察、多领会，日积月累、潜移默化之中就会水到渠成、瓜熟蒂落！思维要开放、活跃，不要固步自封、按部就班，因循守旧。一定要不断思考，注意查询文献，收集各方面信息，培养自身的专业素养与专业敏感度，不要怕遇到问题，越是
3、遇到问题、将其解决，就越能不断提高与进步。工作中经常遇到的问题是否思考过？/按中国药典进行注射用水pH值测定时，为何数值总是在波动？/薄层色谱法检测有关物质、当供试品溶液主成分斑点“断腰”时，是否包含有杂质？以及杂质斑点应如何定量？/使用氢氧化钠滴定液测定含量时，为何测定结果总是偏高？有时甚至超过101.0%？/ HPLC法测定有关物质时、最小峰面积应如何设定？我们已经走得太远，以至于忘记了为什么而出发。黎巴嫩著名诗人纪伯伦（18831931）工作感悟 希望此次学习班能给大家今后的工作有所启迪与感悟 欢迎大家在课间休息时、会议结束时多提问，或是递交纸条上来对大家的期待研发)仿制药既有质量标准可
4、参照无质量标准可参照（仅有参比制剂可获得）)创新药质控研究思路研发：有质量标准可参照的情况(1) 尽可能获得质量标准(2) 尽可能获得“参比原料”。(3) 但千万不要迷信既有标准，在研究的基础上予以理性、科学、辩证的分析。国内申报时讲述英国药典与进口质量标准案例做DMF出口时根据委托方要求、质量越优越好！溶解度会因结晶溶剂的不同导致结果的差异性，一般不做硬性规定，酌情处理。只是操作时样品一定要研细后进行。晶型D采用X-粉末衍射法予以研究测定，有时亦能采用红外予以明辨。列举质量标准中已有拟订的“阿德福韦酯”和“那格列奈”实例。D “西咪替丁”国内几乎均为“非有效晶型”，其根本原因在于中国药典质量
5、标准拟定错误所致！D质量标准如拟定采用X-粉末衍射法鉴别晶型，仪器校正内容至关重要！熔点终熔点应在规定范围内，且应尤为关注熔程范围，这代表样品的纯度与优良性能（列举案例）。一般情况下、终熔点越高、纯度越高；初熔点越高、品质越优良！升温速率一定要注意。紫外光谱鉴别波峰与波谷的鉴别此处不再赘述。230nm以下的波长建议不要设定，因有末端吸收的干扰（列举仿制实例）。肩峰鉴别采用导数光谱法，在一阶导数，肩峰为波峰或波谷，从而可以更加细微地进行定性。肩峰、即为拐点、只能采用导数予以明辨。红外鉴别2000cm-1 400cm-1波数指纹区间，以8大主峰位置相同即可（所谓波数相同、以不大于2cm-1为准、一
6、定要标注波数），可以比例不一。一些个别小峰完全可以存在、可以不同，是杂质峰。HPLC法保留时间一致鉴别与TLC法斑点Rf值一致的鉴别为何质量标准中有时要同时拟定两项，是否“画蛇添足”？其实不然！HPLC法为反相、TLC法为正相，殊途同归，方能胸有成竹！即从不同角度获得同一结果，所下定论才更有说服力！列举“气相色谱法鉴别残留溶剂实例”！以及其后的“原料药含量测定实例”！pH值z一定记录每批样品的测定值，观测其波动范围。对于需稳定一段时间才能记录的样品，需予以特别关注，并在质量标准中予以注明。z许多质量标准拟定得过于宽松、竟然有3个跨度，已失去了意义！建议获得“参比原料”或其他厂家产品予以测定，做
7、到“知己知彼、百战不殆”！这也是工作主动性与能动性的体现。溶液的澄清度与颜色建立梯度对照，观测样品接近何点，以对生产的稳定性予以明辨。对于这种限度比较的、一定要采用梯度对照来明辨！切不可只与限度比较。杂质吸收度的拟定产生的杂质在可见光处有吸收，即带有色泽，主要色泽测定波长如下表。505nm465nm450nm445nm435nm430nm检测波长红色棕色橙红色橙黄色黄色黄绿色色泽质量研究时发现原料粉末（溶液）颜色不断变深，采用紫外在以上波长处测定，发现稳定性考核样品该该检测波长处的吸收度值不断增加，根据稳定性考核结果，设定限度值。记录每批样品测定值，观测其波动范围。氯化物、硫酸盐、磷酸盐和其他
8、无机阴离子z其毒性无关痛痒，为何还要拟定、且限度如何理解？z其目的是控制合成工艺的稳定性，观测大生产情况的均一性，所以样品测定时一定要采用梯度对照。如限度规定不得过0.1%，可将对照设定为0.1%、0.05%、0.02%。0.01%与空白的梯度，以知晓样品中氯离子大约存在量，并将该检测结果反馈给生产部门，以便让生产部门更好地控制合成过程中有关氯化物的的使用与处理。)最终质量标准如能省略、最好不拟定入！)但一定要作为内控标准！干燥失重和水分(1) 一些缓慢降解的物质、不易采用恒重，规定时间。一般105、3小时肯定已可以！典型案例盐酸西布曲明，见下。(2)带有结晶水的药物，尽量采用卡氏法测定。其中
9、的环丁基较为“脆弱”，不断缓慢分解。应采用卡氏法测定。重金属检测其目的是控制合成工艺的稳定性，观测大生产情况的均一性。检测时一定要采用梯度对照，以知晓关于样品的更多信息。如拟定不得过20ppm，检测时可分别标准为20ppm、15ppm、10ppm、5ppm。残留溶剂研究思路研究原则：合成过程中使用到的有机溶剂均需建立测定方法、并予以研究测定。观测样品测定结果：大生产510批样品测定结果说明工艺的稳定性。最后一步重结晶溶剂一般均会有所残留。质量标准拟定原则：除第一类溶剂外、未检出的完全可以不拟定，仅拟定最后一步重结晶溶剂。残留溶剂研究思路质量标准拟定原则：如仅残留有重结晶溶剂、且为低沸点（如乙醇
10、、丙酮等），完全可采用105干燥失重方法予以替代。从而省略掉气相测定，且干燥失重限度可酌情放宽。质量标准是一个不断完善的过程：6列举“自套枷锁”、“事倍功半”实例！6列举阿法骨化醇无需研究测定实例！气相色谱仪操作人员与注意事项z由于气相实验需要操作者与仪器互动，故强烈建议男同志负责此项工作！z如是女同志、做不好情有可原，一定要理解与谅解！z衬管的清洗至关重要。z进样针试验后一定要尽快清洗掉、如为自动进样，设定洗脱程序。z每次色谱柱时色谱柱可截掉0.51.0cm。残留溶剂的检测方法z进样方式：首推溶液法直接进样，几乎所有溶剂皆可气化、被检测，且灵敏度高；当主成分在气化室被破坏，产生降解峰干扰残留
11、溶剂检测时，可以首先降低进样口温度，如能排除，即可！实在排除不了、才采用顶空法！/顶空法缺点：无法使低沸点与高沸点的残留溶剂完全气化，使检测结果比实际结果低，造成错误判断！列举高沸点残留溶剂“二甲基甲酰胺”测定实例！残留溶剂的检测方法z强烈建议采用内标法、即便拥有自动进样。)内标法配制技巧：预先配制内标液，采用该溶液配制对照品溶液和供试品溶液。不要采用“加入”方式！)内标物选择依据：根据沸点、尽可能选择与被测溶剂相近的烷烃类化合物。z色谱柱选择依据：根据“极性相似相容”原理选取色谱柱类型，柱效一般均可达10000以上。（列举测定“乙醇”选取“HP-1柱”的错误实例）残留溶剂检测方法)对照品溶液
12、浓度设定：一定要设定为限度值。)溶剂选择：一定要能溶解所有物质，决不允许不溶解物存在（列举错误实例）。)检测器的选择：测定含卤素的残留溶剂（氯仿、二氯甲烷等），建议采用电子捕获检测器(ECD)。)另类测定法：某些具有紫外吸收的残留溶剂，采用HPLC法测定。如“吡啶”等。原料药质量标准中必须拟定、即便没有降解产物，亦需要通过控制合成中间体的限度来控制合成工艺的稳定性。既有质量标准存在时)出发点：以既有质量标准为参照。)更改和完善：如与既有标准不一致，一定要经过充分的对比研究列举现今最为时髦的“氯吡格雷研究案例”)可提高之处：杂质限度要求、增加单个杂质限度规定、流动相中有机相比例减少、加入杂质校正
13、因子、增加供试品溶液浓度，增加梯度对照等如何看待质量标准是一把“双刃剑”！按照既有质量标准、分别检测参比原料药和自制品，将得到的有关物质测定图谱予以比对研究。同时，采用DAD检测器对各检出峰予以紫外图谱的扫描，确证一致性！a.如自制品每一杂质均未超出参比原料药，则可结束研究。b. 如自制品中有超过参比原料药的杂质，但仍小于质量标准所要求限度，亦可结束研究。仿制原料药有关物质研究思路c. 如自制品中有超出质量标准限度值上的杂质，建议继续进行工艺研究提纯，强烈不建议进行遗传毒性研究法！)但如该杂质本身就是主成分制成制剂后在体内的主要代谢物，且经查阅文献、证实无毒无副作用，则可根据实际情况予以酌情放
14、宽限度。（列举英国药典技术壁垒的实例）)如为合成中间体，稳定性试验中不增加，通过查阅文献证实无毒无副作用，则可根据实际情况不进行研究。仿制药有关物质研究思路从检测方法来讲、主要有HPLC法与TLC法，还有少部分GC法。讲述两法优缺点，绝不要有“HPLC法一定优于TLC的”错误理念！一味地将TLC法改为HPLC法！英国药典中就有数个品种采用两法检测有关物质的做法。讲述TLC法检测时，应建立“梯度对照”理念！通过“半定量”概念对稳定性考核样品予以科学评估！绝不要有“小于自身稀释对照溶液主成分斑点即可”的简单懒散理念！有关物质检测方法此处着重讲述归一化法与自身对照法的优缺点、如何灵活运用该两方法，获
15、得事半功倍的工作效果。穿插线性试验原理、线性试验意义，并列举实例。对于未知杂质、不降解杂质，采用主成分自身稀释法(1) 怪异结构式唑来膦酸的结构式：(2) 梯度洗脱时，柱效亦不是正常体现，高达2万，故无需拟定。(3) 该组分几乎位于死体积出峰、在色谱柱上几乎无保留出峰时，亦不成线性。PPHOOOHOHOOHOHNN1、杂质对照品进行定量测定。D简便易行、不受耐受性因素影响。D纯度无需特别高、只要能够得到准确纯度值即可。D资料中一定要提供该杂质对照品精制方法与质量标准。容量分析法消耗样品量较大、高效液相法存在“同一波长下、各物质校正因子的不同”之缺陷（此处着重讲述两法优缺点）。D最佳境界为“殊途
16、同归”！对于降解杂质，应予以着重关注推荐采用HPLC、归一化法，波长的确定可通过“分别对所检测出的各物质通过二极管阵列检测器进行波长扫描，确定各物质吸收基本相同的波长予以测定。并最好通过能找到一专属性强的容量分析法，然后采用电位滴定予以佐证HPLC法结果。引申至主成分对照品纯度验证，同样可以如此！着重阐述！杂质对照品纯度如何测定？2、杂质对照品定位、主成分自身稀释法。该法是在无法长期提供纯度较高、满足定量检测的杂质对照品情况下采用。但仍能提供纯度不高、可供于定位的杂质对照品。此时、一定要知晓该杂质对于主成分的“校正因子”！在进行质量研究时，得到少部分已知准确纯度的该杂质对照品，配制与主成分相同
17、浓度的混合溶液，连续进样数次得到平均峰面积，然后计算出各杂质对于主成分的校正因子。校正因子在0.91.1间时便可忽略，范围外均应予以详注！对于降解杂质，应予以着重关注3、不采用杂质对照品定位、采用相对保留时间的主成分自身稀释法。一定要确定色谱柱具体型号，否则极易导致定位错误，造成误判！绝不推荐采用不确定色谱柱型号的行为，“无异于自杀”，“不要害怕不批准”！不建议进行大量的耐受性试验来应对！对于降解杂质，应予以着重关注(1) 波长取主成分、合成中间体和降解产物对照品，配制成一定浓度后进行紫外扫描。如采用主成分最大吸收波长，需进行各杂质校正因子的测定。(2) 流动相取主成分和各杂质对照品，配制成主
18、成分浓度为100%、各杂质浓度为1%的溶液进样测定，验证色谱系统的适用性。绝不要将各物质皆配制成1%浓度！各试验参数的建立过程：方法学验证内容专属性试验验证图谱(3) 供试品溶液浓度通过最小检出限来确定。最小检出限如何测定、如何理解？信噪比的3倍、纯属“纸上谈兵”，实践中根本用不上！最小检出限向上推至少500010000倍，即为供试品溶液浓度。最小检出限的精髓是相对值、即相对于供试品溶液浓度多少分之一、该点才是有关物质测定的核心所在！引申至检测时最小峰面积应如何设定？含量测定浓度如何设定？各试验参数的建立过程：方法学验证内容最小峰面积的设定其设定，不是绝对值，而是相对值。英国药典中有明确的说明
19、：凡有关物质的检测采用HPLC法测定时，均规定舍弃对照溶液主峰面积几分之几的峰面积。普通样品测定时，通常为1/10 1/20（即相当于样品测定浓度的0.1%0.05%）。如规定杂质限度为1.0%，对照溶液峰面积为10000，那么，最小峰面积可考虑设定为1000500左右。新药稳定性考核时，可设定到0.01%的最小峰面积。原料药销售与购买的合同中，为确保双方达成一致意见，此点应予以重视。(1)最大进样量(2) 有关物质测定供试品溶液浓度、(3)含量测定浓度(4)有关物质测定自身稀释对照溶液浓度(5)最低检出限五者间的比例关系“基准点”0.01%0.1ng10l10ng/ml最低检出限100倍1.
20、0%10ng10l1.0g/ml有关物质自身稀释对照溶液浓度1000倍10%10l10g/ml含量测定浓度10000倍100%1g10l0.1mg/ml有关物质供试品溶液浓度10l0.3mg/ml最大进样量倍数关系相当于供试品溶液浓度的绝对量进样量浓度强力破坏试验水破坏取原料适量，加水溶解后，在90放置24小时。氧化破坏取原料适量，用5%过氧化氢溶液溶解后，在90放置24小时。强碱破坏取原料适量，用1mol/L氢氧化钠溶液溶解后，在90放置24小时。强酸破坏取原料适量，加1mol/L盐酸溶液溶解后，在90放置24小时。高温破坏取原料适量，依据各自品种的熔点不同，在高温下破坏至外观性状改变强光破
21、坏取原料适量，置紫外灯下照射48小时。历史来源、又是“发达国家套在非发达国家身上的技术枷锁”！首先测定未破坏前供试品溶液图谱。然后进行“酸、碱、氧化、热、光照”等条件的破坏，可能会出现某一条件下极其稳定，完全可以，不是一定要破坏出杂质！但绝不可能在任何一个条件下均稳定，除非“金子、银子”。对于强破坏试验的科学理解破坏出的杂质量最好为20%30%间（这也是不拟定破坏具体程序的原因所在），并采用DAD检测器检测主成分峰纯度，纯度系数应符合规定。如不纯、说明包含杂质，讲述鉴别方法、列举实例！同时讲述DAD检测器的局限性和波长扫描范围的确定应知晓！一般情况下均不会推翻已建立的色谱条件。如检测主成分峰不
22、纯、降低流动相中有机相的比例（引申至正相中醇类作为调节剂、微小比例的变化均会引起较大波动的实例。讲述简便易行的配置方法，且无需过滤、直接超声即可使用的技巧）。对于强破坏试验的科学理解min0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24mAU60708090100110120130140150160mAU6070809010011012013014015016091708 5.923 0.86104328888.410 98.1659185 14.626 0.5645002 22.729 0.422 : 2 1 0 n m , 8 n m傾乕僥僗僱乕僩昗 弨梟塼傾乕僥僗僱乕僩
23、昗 弨梟塼02-Rep4柺愊曐帩帪娫柺愊%0.96RSD0.42%4500020.56%5918598.16%104328880.86%9170830.36%380650.56%5917298.33%103603860.75%7894820.32%338980.57%5952198.45%103445410.66%689801.50.30%317170.55%5809898.58%103823880.57%5952010.22%223310.54%5578698.89%101465250.35%360280.50.05%50320.55%5751199.26%103696000.14%1481
24、10均未检出百分比峰面积百分比峰面积百分比峰面积百分比峰面积时间 (h)新杂质杂质 -3杂质 -2青蒿琥酯杂质 -1（为已知杂质）耐受性试验中最为核心的一项：溶液稳定性质量标准中有关物质测定法拟定原则采用杂质对照品法、用于降解产物的准确测定，如氢氯噻嗪、对乙酰氨基酚等的测定。尤对于复方制剂有关物质的测定！采用强破坏试验破坏出杂质验证系统适用性。如中国药典中的氧氟沙星所有品种，均在HPLC法的色谱条件下拟定了：取供试品溶液，置紫外灯下（254nm）照射4小时以上，使产生的紧邻主峰前的杂质峰与主峰的分离度应符合规定。采用最难分离的杂质对照品验证系统适用性。采用不断降解杂质对照品验证系统适用性。典型
25、强破坏试验图谱min0 5 10 15 20 25 30 35 40mAU 0246VWD1 A, Wavelength=280 nm (XMF05112203.D)15.753min0 5 10 15 20 25 30 35 40mAU 0246VWD1 A, Wavelength=280 nm (XMF05112204.D)14.81215.928min0 5 10 15 20 25 30 35 40mAU 0246VWD1 A, Wavelength=280 nm (XMF05112205.D)薄层色谱法测定有关物质(1)一定采用25cm长板。如为自行铺制、应与购买来的预制板比较，观测检
26、测结果有无明显差异。(2)以主斑点“不断腰儿”为准，可适当增加供试品溶液浓度，观测是否能检测出更多杂质斑点。(3)一定程度上改变展开剂比例，观测主斑点中是否能分离出其他小杂质斑点。薄层色谱法测定有关物质(4)对照（品）溶液斑点一定要建立成梯度对照，如设定杂质斑点不得过1.0%自身稀释主斑点，一定要增加0.5%、0.2%和0.1%三个斑点，特别是0.1%斑点，以指示出当时试验时的灵敏度，灵敏度的最低要求是0.1%，如显示不出，增大点样量，直至显示出。从而在合格基础上，可对杂质斑点有一“半定量”的评估，这对于生产的控制、稳定性考核皆极为重要。手性药物中异构体的测定z强烈建议采用正相测定，勿采用反相
27、色谱柱/手性流动相和手性色谱柱/反相流动相，这对色谱柱的损伤尤为严重、且重现性极差。)此处提及如何清洗色谱柱以及流动相使用方式注意点。含量测定（容量分析法）（1）专属性差。由于杂质亦具有该官能团、也消耗滴定液，所以一般导致结果偏高、因杂质分子量均小于主成分；所以规定101.0%的上限。（2）颜色难以辨别时、指示剂重新配制。如仍难以辨别、查询反应原理。滴定终点一定要有“感觉”！（3）有空白试验时、样品最终滴定的颜色与空白应一致！（4）根据消耗体积、选择滴定管规格。含量测定（容量分析法）（5）实在难以辨别时、改用电位滴定法确证。电位滴定法对于体积几乎无要求、原理决定！（6）“一题多解”、“多角度分
28、析”典型案例剖析。氢卤酸盐类药物容量分析方法。NnHCl（或 HBr）Nz高氯酸滴定法取一定量的样品，加冰醋酸3050ml（如有结晶水，则需再加入醋酸酐20 30ml）和醋酸汞试液5ml，用高氯酸滴定液（0.1mol/L）滴定，使用指示剂指示终点（或采用电位法指示终点），每1ml高氯酸滴定液（0.1mol/L）相当于0.1毫摩尔物质量。z氢氧化钠滴定法取一定量的样品，精密加入0.01mol/L盐酸溶液5ml和乙醇（或丙酮、异丙醇等能与水相溶的适宜溶剂）3050 ml，用氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）滴定，电位法指示终点，读取第二个等当点体积，同法做空白试验。每1ml氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）相当于0.1毫摩尔的物质量。
