1、重组质粒构建生物学屠仁军(新浪)一、载体与外源片段（PCR 产物）的双酶切为了保证做连接反应时有足够的外源 DNA 片段，应该加入 1ug的 DNA 进行酶切反应；两种酶分别加 1ul，10buffer 2ul，1ug 的DNA，加水至 20ul。（因此要跑胶分析 DNA 以及载体的浓度，取 1-2ul，电泳检测其含量。1ul 体积太少，可以将其稀释在 9ul 水中，再加 loading buffer。6ul 15000bp 的 marker，2500bp 条带的亮度约是 100ng DNA。可对比 marker 的亮度算出酶切回收的 DNA 的浓度，以便于确定连接反应时的用量。Image J
2、 软件可以做灰度分析。）双酶切反应结束后，使用 PCR cleanup 试剂盒回收 DNA 与载体。回收完之后用同样的方法分析其浓度。（也可以用分光光度计直接测量 DNA 的浓度，但是，一般酶切反应之后其浓度会比较小，取1ul 稀释 100 倍之后浓度很低，可能已经低于仪器的测量范围，而电泳灵敏度很高，还可一排除杂带、RNA、蛋白质等对浓度的干扰。）二、连接反应载体 100ng，DNA 片段根据大小，1ul buffer，1ul T4 连接酶，加水至 10ul；16连接 12-16h。载体（约 0.03pmol）与外源 DNA 的摩尔比大约 1：3-1：10 之间，根据载体与 DNA 片段的长
3、度，可算出需要的量。因为载体的大小一般在 5kb-10kb，因此，严格的算出 0.03pmol 的载体的质量意义不大，大约 100ng 即可。如果时间比较紧张，可以 25连接15min，之后可取 5ul 进行转化，剩余 5ul 于 16继续连接。三、质粒转化到感受态大肠杆菌中从-70中取出感受态，指尖轻转融化后立即插入冰上，5ul 连接产物+100ul 感受态大肠杆菌，充分混匀后冰浴 30min，然后 42热激 90s，热激时不要晃动 EP 管。然后立即插入冰上，静置2min。（连接产物的量尽量不超过感受态体积的 5%，否则会降低转化效率，从而得不偿失。）在超净台中向 EP 管中加入 700u
4、l 无抗性 LB 培养基，然后 37摇床培养 45min-1h；4000rpm 离心 3min，在超净台中弃去 700ul 上清，然后轻轻吹打残留的菌液沉淀，涂平板；（涂平板的玻璃棒要在酒精灯上烧热灭菌，后冷却）37培养箱先正放 15min，之后倒置培养 12-16h。（超过 16h，则阳性克隆周围会生出卫星菌落，原因是阳性克隆会分泌水解氨苄的酶到培养基中，水解其周围的氨苄，因此，平板上的 DH5、杂菌等会生长。）四、重组子的挑取培养挑选单克隆到 2ml LB 培养基中，37培养 8-16h，可提质粒。（要在管壁上部用注射器的针头烧热，戳个小洞，因为大肠杆菌是好氧的，无菌会生长缓慢）其实在挑克
5、隆培养的时候就可以 PCR 鉴定，先配好 PCR 反应体系，在超净台中，同一个克隆，一半用于摇菌培养，一半用小的枪头挑取在对应的 PCR 体系里涮一下，即可作为模版进行 PCR 反应。PCR 时要做阴性、阳性对照。阴性对照，用枪头在没有菌落的培养基上沾一下做模版（PCR 灵敏度很高，要排除连接体系中的残留的 DNA 对结果影响的可能），阳性对照用最初 PCR 扩增 DNA 片段时的模版。也可以等 37培养 8-16h 之后取 1ul 菌液做模版鉴定，或者提质粒之后，用质粒做模版进行鉴定，均可。五、质粒的提取与电泳检测1. 在超净台中取 300ul 菌液与无菌 EP 管中，4保存，待鉴定是否成功
6、后取 100ul 菌液+100ul 50%甘油保种，送 200ul 菌液到公司测序，不正确的丢掉即可。（如果质粒量很多，也可以送 5-10ul质粒测序）2.取 1ml 菌液到新的 EP 管,12000 rpm 离心 30s，弃上清，再将700ul 剩余菌液于同一 EP 管，12000 rpm 离心 30s，弃上清。然后瞬时离心，将残留液体吸干。（枪头不能重复使用）3.加入预冷的 200ul 溶液 I(4低温保存)。反复吹打混匀。（一定要混匀，不然会影响裂解效果，可以用涡旋混合器震荡混匀）4.加入 200ul 溶液 II，盖紧管口，轻轻快速颠倒离心管 3-5 次。（不要剧烈震荡，防止基因组 DN
7、A、质粒断裂，可以悬空加试剂，这样不用换枪头，而且比较快，下同）5. 观察到溶液变清后，立即加入预冷的 200ul 溶液 III。颠倒3-5 次，颠倒时用手指轻弹离心管底部，混匀。冰浴5min。12000rpm 离心 10min。6.取 400ul 上清至另一干净的离心管中（尽量不要吸到白色的沉淀物质，如果效果不理想，可以转移 400ul 上清至新离心管，12000rpm，5min，之后在转移上清），加入 500ul 异丙醇，充分混匀。室温放置 2min，12000rpm 离心 10min。7. 弃上清，加入 700ul 75%的乙醇，轻轻颠倒两次，12000rpm离心 5min，重复操作一次
8、。8.弃上清，然后瞬时离心，用 Tip 头将残留酒精吸干。空气中干燥 10min。9.加入 50-100ul Elution Solution(65预热)溶解质粒。10.取 1ul 质粒，加 9ul DDW，2ul 6*loading buffer，混匀电泳检测质粒浓度。六、酶切鉴定或者 PCR 检测大约酶切 1ug 质粒进行鉴定。如果质粒含量太少，即便能够切下目的条带，也有可能看不到。（为了节约，鉴定时取 0.25-0.5ul的酶，20ul 体系，酶切 30min-1h，即可电泳跑胶）PCR 检测，则将提取的质粒稀释 10-100 倍到适合做模版的浓度（taq 酶的说明书上有说明），利用目的
9、片段的引物，使用普通的taq 酶 PCR 即可。注意事项：1.移液器使用结束后调回最大量程放归远处。2.本实验属于微量操作，用量极少的步骤必须严格注意吸取量的准确性并确保样品全部加入反应体系中。3.不论是酶切还是连接反应，加样的顺序应该是，先加双蒸水，其次是缓冲液和 DNA，最后加酶。而酶液要在加入前从-20的冰箱取出，酶管放置冰上，取酶液时吸头应从表面吸取，防止由于插入过深而使吸头外壁沾染过多的酶液。取出的酶液应立即加入反应混合液的液面以下，并充分混匀。4.Ep 管的盖子应盖紧，防止水浴过程中水汽进入管内，并做好标记以防样品混淆。5.制备凝胶时，应避免琼脂糖溶液在微波炉里加热时间过长，否则溶
10、液将会暴沸蒸发，影响琼脂糖浓度。制胶时要除去气泡。拔梳子时要特别小心，以防凝胶与支持物脱离。6.上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部的凝胶刺穿。也不要快速挤出吸头内的样品，避免挤出的空气将样品冲出样品孔。7.紫外线对眼睛和皮肤均有伤害，对眼睛尤甚。观察电泳条带时要确保紫外光源得到适当遮蔽，并应戴好目镜或眼罩，避免皮肤直接暴露在紫外线下。割胶回收动作要快，避免紫外照射时间过长，使得 DNA 突变。8.实验中注意更换枪头，以避免试剂的污染，悬空滴加试剂的话，可以连续使用。碱裂解法质粒提取的原理溶液 I，50 mM 葡萄糖/25 mM Tris-Cl/10 mM EDTA，pH 8.0；溶液
11、 II，0.2 N NaOH/1% SDS；溶液 III，3 M 醋酸钾/2 M 醋酸。溶液 I 的作用葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液 I 中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。所以说溶液 I 中葡萄糖是可缺的。EDTA是 Ca2+和 Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制 DNase 的活性，和抑制微生物生长。在溶液 I 中加入高达 10 mM 的 EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加 EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质
12、粒抽提，就不用怕DNA 会迅速被降解，因为最终溶解质粒的 TE 缓冲液中有 EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液 I，可不可以抽提质粒呢？实话告诉你，只要用等体积的水，或 LB 培养基来悬浮菌体就可以了。有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。溶液 II 的作用这是用新鲜的 0.4 N 的 NaOH 和 2的 SDS 等体积混合后使用的。要新从浓 NaOH 稀释制备 0.4N 的 NaOH，无非是为了保证 NaOH 没有吸收空气中的 CO2 而减弱了碱性。其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。事实上 NaOH 是最佳 的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，
13、碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从 bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。用了不新鲜的 0.4 N NaOH，即便是有 SDS 也无法有效溶解大肠杆菌，自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用 SDS 当然也能抽提得到少量质粒，因为 SDS也是碱性的，只是弱了点而已。很多人对 NaOH 的作用误以为是为了让基因组 DNA 变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关 DNA 变性复性的描述所导致。有人不禁要问，既然是 NaOH 溶解的细胞，那为什么要加 SDS 呢？那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，因为在这样的
14、碱性条件下基因组 DNA 片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组 DNA也会断裂。基因组 DNA 的断裂会带来麻烦。溶液 III 的作用溶液 III 加入后就会有大量的沉淀，但大部分人却不明白这沉淀的本质。最容易产生的误解是，当 SDS 碰到酸性后发生的沉淀。如果你这样怀疑，往 1%的 SDS 溶液中加如 2M 的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了。大量沉淀的出现，显然与 SDS 的加入有关系。如果在溶液 II 中不加 SDS 会怎样呢，也会有少量的沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。既然 SDS 不是遇酸发生的沉淀，那会不会是遇盐发生的沉淀呢？在 1的 SDS 溶
15、液中慢慢加入 5 N 的 NaCl，你会发现 SDS 在高盐浓度下是会产生沉淀的。因此高浓度的盐导致了 SDS 的沉淀。但如果你加入的不是 NaCl而是 KCl，你会发现沉淀的量要多的多。这其实是十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS），而 PDS 是水不溶的，因此发生了沉淀。如此看来，溶液 III 加入后的沉淀实际上是钾离子置换了 SDS 中的钠离子形成了不溶性的 PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。大家知道 SDS 专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个 SDS 分子
16、，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组 DNA 也一起被共沉淀了。这个过程不难想象，因为基因组 DNA 太长了，长长的DNA 自然容易被 PDS 给共沉淀了，尽管 SDS 并不与 DNA 分子结合。那么 2 M 的醋酸又是为什么而加的呢？是为了中和 NaOH，因为长时间的碱性条件会打断 DNA，所以要中和之。基因组 DNA 一旦发生断裂，只要是 50100 kb 大小的片断，就没有办法再被 PDS 共沉淀了。所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组 DNA 混入，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总 DNA 条
17、带。很多人误认为是溶液 III 加入后基因组 DNA无法快速复性就被沉淀了，这是天大的误会，因为变性的也好复性的也好，DNA 分子在中性溶液中都是溶解的。NaOH 本来是为了溶解细胞而用的，DNA 分子的变性其实是个副产物，与它是不是沉淀下来其实没有关系。溶液 III 加入并混合均匀后在冰上放置，目的是为了 PDS 沉淀更充分一点。质粒检测琼脂糖电泳进行鉴定质粒 DNA 时，多数情况下你能看到三条带，但千万不要认为你看到的是超螺旋、线性和开环这三条带。碱法抽提得到质粒样品中不含线性 DNA，不信的话你用 EcoRI 来线性化质粒后再进行琼脂糖电泳，就会看到线性质粒 DNA 的位置与这三条带的位置不一样。其实这三条带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。如果你不小心在溶液 II 加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，是 20-100kb 的大肠杆菌基因组 DNA 的片断。 非常偶然的是，有时候抽提到的质粒会有 710 条带，这是由于特殊的 DNA 序列导致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈数不同）所致。
