1、1实验一 多酚氧化酶活性测定（3 学时）一、实验目的：掌握测定多酚氧化酶活性的方法；了解多酚氧化酶的特性二、实验原理：多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，能使一元酚和二元酚氧化生成醌。醌有颜色，在 525nm 下有最大光吸收，通过分光光度法测定反应体系颜色变化可测定酶活性。三、器材与试剂低温离心机、s22pc 分光光度计、儿茶酚、 pH 7.2 磷酸缓冲液四、实验内容：1称取马铃薯 0.5 克，加入 2.5mL pH 7.2 磷酸缓冲液，少许 PVP，研磨匀浆，转移到离心管，再用 2.5mL pH 7.2 磷酸缓冲液冲洗研钵，合并提取液。4 4000rpm 离心 15 分钟，上清液即为粗酶液。2在试
2、管中，加入 2.5mL pH 7.2 磷酸缓冲液，1.5mL 儿茶酚以及 1mL 粗酶液，空白调零以 1mL 磷酸缓冲液代替粗酶液。3A 值测定：加入粗酶液后迅速混匀，立刻于 525nm 下测定反应体系的 A 值，每隔 30 秒记录一次，共记录 5 次。4计算酶活力。按下式计算PPO 活性 U/min gFW A 值增加 0.001 定义为一个酶活力单位。五、实验报告：计算所测材料的 PPO 活性。选择 A 值变化均匀的三组数值求平均值。实验二 植物耐盐生理指标测定（9 学时）一、实验目的：1、了解盐胁迫的机理以及植物的耐盐机制2、了解植物盐处理的方法3、掌握植物体内脯氨酸含量测定的原理和方法
3、4、掌握过氧化物酶活性的测定原理和方法5、掌握丙二醛含量的测定方法6、掌握基本的数据统计方法二、实验原理 植物在盐胁迫下,植物可通过积累一定量的脯氨酸降低水势, 维持植物体内的水分平衡, 保证植物的正常生长。脯氨酸本身是一种水溶性最大的氨基酸，它可以防止原生质体的水分散失，在植物细胞生理干旱时，它的增加有助于细胞或组织保持水分。用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在 520nm 波长下比色，从标准曲线上查出脯氨酸的含量。植物在盐胁迫下，活性氧含量会明显增加，对植物体产生毒害，而过氧化物酶会清除
4、植物体内多余的活性氧 。过氧化物酶广泛存在于植物的各个组织器官中。在有过氧化氢存在的条件下，过氧化物酶可以使愈创木酚氧化，产生茶褐色物质，在 470nm 处有最大吸收峰，可根据单位时间内 A470 的变化值，计算 POD 活性大小。植物在盐胁迫下，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛是其产物之一，通常将其作为脂质过氧化指标，用于表示细胞膜脂过氧化程度和植物对逆境条件反应的强弱。丙二醛（MDA）是常用的膜脂过氧化指标，在酸性和高温度条件下，可以与硫代巴比妥酸（TBA）反应生成红棕色的三甲川（3,5,5-三甲基恶唑 2,4-二酮） ，其最大吸收波长在 532nm。但是测定植物组织中 MDA 时受多种物质
5、的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与 TBA 显色反应产物的最大吸收波长在 450nm，532nm处也有吸收。植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中 MDATBA 反应物质含量时一定要排除可溶性糖的干扰。三、实验主要仪器和试剂仪器: 离心机；分光光度计；恒温水浴锅试剂：酸性茚三酮溶液；冰醋酸；标准脯氨酸溶液；3磺基水杨酸；过氧化物酶测定反应液；pH6.0 磷酸缓冲液10TCA；0.6TBA四、实验步骤（一）实验材料的培养小麦种子吸胀 8h 后消毒、4下春化 30 天，采用砂培法种植，至三叶期，作为供试材料。（二）盐胁迫处理2用 200 mmol/L NaCl 对小
6、麦进行盐胁迫，以未进行盐胁迫为对照，以进行盐胁迫为处理，盐胁迫 3d 后分别测定脯氨酸含量、过氧化物酶活性和丙二醛含量，对照和处理分别重复 3 次。（三）脯氨酸含量测定1.标准曲线的制作用 100g/ml 脯氨酸配制成 0.4、0.8、1.2、1.6、2.0g/ml 的标准溶液。取标准溶液各 2ml,加 2ml3% 磺基水杨酸，2ml 冰醋酸和 4ml2.5% 茚三酮试剂于具塞试管中，置沸水浴中显色 1h，冷却后与波长 520nm 测定 A 值，以A 值为纵坐标，脯氨酸浓度（g/ml）为横坐标绘制标准曲线。2.脯氨酸的提取 称取小麦叶片 0.2g（每个处理设 3 个重复） ，加 3%磺基水杨酸
7、 5ml 研磨提取，匀浆移至试管中，在沸水浴中提取 10min，冷却后，4000rpm 离心 20min，上清液即为脯氨酸粗提液。3.反应体系取上清液 2ml，并加入 1ml 冰醋酸，2ml 酸性茚三酮，混匀置于沸水浴中显色 0.5h。以 2ml 磺基水杨酸，1ml冰醋酸，2ml 酸性茚三酮为对照。在可见分光光度计下 520nm 处测得 A 值。4. 脯氨酸的含量的计算从标准曲线查得脯氨酸浓度，计算出样品中脯氨酸的含量，以每克材料鲜重含脯氨酸的微克数表示（g/g） 。（四）过氧化物酶活性的测定 1.过氧化物酶的提取称取小麦叶片 0.2g（每个处理设 3 个重复） ，加 5ml pH 6.0 的
8、磷酸缓冲液，再加入 0.02g PVP-30（除去酚类物质的毒害，防止醌类物质的干扰）及少量石英砂研磨。4，4000rpm 离心 15 分钟，上清液为酶粗提取液2.反应体系25l 酶粗提取液加入 4ml 反应液，在可见分光光度计下 470nm 处测 A 值，放入后立即记时，每隔 20s 记一次数值，连续记录三次，取平均值。3.酶活力定义过氧化物酶活性以每克鲜重每分钟在 470nm 下 A 值的变化值，设每变化 0.01A 为一个酶活力单位。过氧化物酶活性=U/ming（五）丙二醛含量测定1.丙二醛提取小麦叶片 0.2g（每个处理设 3 个重复） ，加入 10三氯乙酸(TCA)5mL(分两次加)
9、和少量石英砂充分研磨，匀浆液以 4000r/min 离心 20min，上清液即为样品提取液。2.反应体系取 2mL 提取液，分别加入 2mL 0.6TBA 液，混匀，在试管上加盖塞，置于沸水浴中沸煮 15min，迅速冷却，离心。取上清液测定 532nm 和 450nm 下的 A 值。以 2mL 水代替提取液调零。3.MDA 含量计算：根据 C6.45A 5320.56A 450，计算出样品提取液中丙二醛的浓度 C，然后再计算出每克样品中丙二醛的含量(mol/g（FW)） 。五、思考问题1.为什么设定重复处理？2.分光光度法要求 A 值在多大范围内，数据才可靠，如何调整？六、实验报告主要内容包括
10、：1.实验目的及要求 2.实验主要仪器和试剂 3.实验原理 4.实验步骤 5.实验结果 6.结果分析 7.回答问题实验三 植物的元素缺乏症砂培法（3 学时）一、实验目的：熟悉植物营养缺乏症的典型症状，熟悉砂培法。二、实验原理：除了水分，植物还需要各种矿质元素来维持正常的生理活动。缺乏矿质元素植物就不能很好的生长，同时还会表现出相应的症状。应用砂培法可以观察矿质元素对植物生活的必需性，并避免土壤里的各种复杂因素。三、器材与试剂：塑料盆、大烧杯、量筒 试剂见实验指导3四、实验内容：1按照实验指导表格配制各种缺素培养液。配制时，先取蒸馏水 900 毫升，然后加入贮备液，最后配成 1000 毫升，调
11、pH 6.0。2将细砂洗净，装入干净的塑料盆内，然后选择长势一致的小麦或玉米幼苗（去掉胚乳）进行移栽，均匀栽种，每盆 810 株。浇灌相应的培养液，贴标签。323 周后观察结果，记录小麦植株的生长状况。 （期间要及时更换培养液）五、实验报告：记录小麦缺素培养的症状，并进行分析。实验四 根系活力测定（3 学时）植物根系是活跃的吸收器官和合成器官，根的生长情况和活力水平直接影响地上部的生长和营养状况及产量水平。本实验练习测定根系活力的方法，为植物营养研究提供依据。一、实验目的：掌握测定根系活力的方法及原理。二、实验原理氯化三苯基四氮唑（TTC）是标准氧化电位为 80mV 的氧化还原色素，溶于水中成
12、为无色溶液，但还原后即生成红色而不溶于水的三苯甲腙，生成的三苯甲腙比较稳定，不会被空气中的氧自动氧化，所以 TTC 被广泛地用作酶试验的氢受体，植物根系中脱氢酶所引起的 TTC 还原，可因加入琥珀酸，延胡索酸，苹果酸得到增强，而被丙二酸、碘乙酸所抑制。所以TTC 还原量能表示脱氢酶活性并作为根系活力的指标。三、材料、设备仪器及试剂（一）材料：水培或砂培小麦根系。（二）仪器设备：1. 分光光度计；2. 电子天平；3. 恒温水浴锅；4. 研钵；5.离心机（三）试剂：1. 乙醇（分析纯） 。2. 次硫酸钠（Na 2S2O4） ，分析纯，粉末。3.1TTC 溶液。4. 磷酸缓冲液（115mol/L，p
13、H7） 。5. 1mol/L 硫酸。四、实验步骤（1）TTC 标准曲线的制作 取 0.4TTC 溶液 0.25ml 放入 10ml 量瓶中，加少许 Na2S2O4 粉摇匀后立即产生红色的甲腙。再用乙醇定容至刻度，摇匀。然后分别取此液 0.25ml、0.50ml 、1.00ml、1.50ml、2.00ml 置 10ml 容量瓶中，用乙醇定容至刻度，即得到含甲腙 25g、50g、100g 、150g、200g 的标准比色系列，以空白作参比，在 485nm 波长下测定吸光度，绘制标准曲线。（2）称取根尖样品 0.2g，放入 10ml 试管中，加入 0.4TTC 溶液和磷酸缓冲液的等量混合液 10ml
14、，把根充分浸没在溶液内，在 37下暗保温 1h，此后加入 1mol/L 硫酸 2ml，以停止反应。 （与此同时做一空白实验，先加硫酸，再加根样品，其他操作同上） 。（3）把根取出，吸干水分后与乙醇 10ml 和少量石英砂一起在研钵内磨碎，以提出甲腙。3000rpm ，15min，上清在分光光度计波长 485nm 下比色，以空白试验作参比测出吸光度，查标准曲线，即可求出四氮唑还原量。五、结果计算四氮唑还原强度（mg/g(根鲜重)/h）四氮唑还原量（mg）/根重（ g） 时间(h)实验五 GA、NAA 对植物生长的影响（3 学时）一、实验目的了解不同的植物激素对植物生长的影响。二、实验原理GA 和
15、 NAA 都能促进植物的伸长生长，但二者的作用有所区别，GA 能够促进完整植株的伸长生长，而 NAA 则不能，只能促进离体组织如茎段、胚芽鞘的伸长。三、器材与试剂：塑料盆、大烧杯 、GA 3（200mg/L） 、NAA （200mg/L）四、实验内容1将培养介质装入干净的塑料盆内。2各取 30 株高度一致的小麦，分为 3 组，去掉胚乳，分别浸入蒸馏水、GA 3（200mg/L）和 NAA（200mg/L）中，4然后移栽到塑料盆内。334 周观察不同处理小麦植株的伸长状况。五、实验报告列表比较各个处理的平均株高。实验六 乙烯对果实的催熟作用（3 学时）一、实验目的：了解乙烯对果实的催熟作用；了解
16、乙烯利的作用机理二、原理：乙烯是植物正常代谢的产物，是植物体内的一种内源激素，能够增加质膜透性，加速呼吸，引起有机物质强烈转化，进而促进果实成熟。而乙烯利是一种人工合成的植物激素，pH4.1 时，分解释放乙烯，而植物细胞液 pH 一般在 5.06.0左右。三、仪器药品4000ppm 乙烯利 大烧杯四、方法：1、取成熟度一致的青香蕉 4 支，2 支放在 4000ppm 的乙烯利中浸泡 1 分钟，另 2 支放入蒸馏水中浸泡 1 分钟，取出后放在黑塑料袋中，避光保存。2、510 天后观察结果，比较果皮颜色和果实成熟度。五、实验报告从果皮颜色和果实成熟度对不同处理进行比较。实验七 叶绿体色素提取、分离
17、及理化性质鉴定（3 学时）一、 实验目的：了解并掌握叶绿体色素的提取、分离的原理和方法；了解叶绿体色素的理化性质；了解叶绿体色素的光学特性在光合作用中的意义二、原理叶绿体含有叶绿体色素，叶绿体色素主要包括有 Chla、Chlb、叶黄素和胡萝卜素，可用有机溶剂乙醇、丙酮等将它们提取出来。纸层析法是分离叶绿体色素最简单的方法。它的原理是利用混合色素中各个成分物理、化学性质的差别，分别以不同程度分布于两相中（即固定相和流动相） 。由于它们以不同的速度移动，从而达到分离的目的。叶绿体色素容易受光的破坏，变成褐色。叶绿体色素具有荧光现象。叶绿素分子的镁可被铜替代，形成铜代叶绿素。叶绿体色素对不同波长的光
18、具有吸收作用。三、方法1、叶绿体色素的提取取菠菜叶子 10g，加石英砂和碳酸钙少许，乙醇约 5ml，研磨成匀浆，再加乙醇 15ml，用漏斗过滤，即为色素提取液。（1） 、纸层析法分离叶绿体色素用滴管吸取上面的色素提取液 45 滴。一滴一滴地滴在滤纸的中央（滤纸要平放在表面皿或培养皿上） 。待色素点风干后，向该色素点上慢慢滴加四氯化碳，使四种色素（叶绿素 a、叶绿素 b、叶黄素、胡萝卜素）在滤纸上分离出来，四种色素在滤纸上的移动速度是胡萝卜素（橙黄色）叶黄素（黄色）叶绿素 a(蓝绿色)叶绿素 b（黄绿色） 。（2）叶绿素的荧光现象取上述色素乙醇提取液少许于试管中，在反射光和透射光下观察色素提取液
19、的颜色有什么不同。反射光下观察到的溶液颜色 ，即为叶绿素产生的荧光现象。（3）铜在叶绿素分子中的替代作用取上述色素乙醇提取液少许于试管中，1 滴 1 滴地加入盐酸，直至溶液出现褐绿色，此时叶绿素分子已遭破坏，形成去镁叶绿素。然后加醋酸铜晶体 1 小粒，慢慢地在酒精灯上加热溶液，使溶液又产生亮绿色，此即表明铜已在叶绿素分子中替代了原来镁的位置。（4）黄色素和绿色素的分离将叶绿体色素的提取液 4 毫升于大试管中，加入 1 毫升 KOH-甲醇溶液，充分摇匀，然后加 5 毫升苯，摇匀，观察分层现象。四、实验报告51、将纸层析法分离叶绿体色素的实验结果贴在实验报告纸上，并给予分析。2、解释叶绿体色素的光
20、学性质。实验八 叶绿素 a 和 b 含量的测定（分光光度法）一、目的学会 Chla、b 含量的测定方法，了解叶片中 Chla、b 的含量。二、材料用具及仪器药品菠菜叶片、721 分光光度计、天平、研钵、剪刀、容量瓶（25ml）、漏斗、滤纸、乙醇（95%）三、原理叶绿素 a、b 在波长方面的最大吸收峰位于 665nm 和 649nm，同时在该波长时叶绿素 a、b 的比吸收系数 K 为已知，我们即可以根据 Lambert Beer 定律，列出浓度 C 与光密度 D 之间的关系式：D665=83.31Ca+18.60Cb.(1)D649=24.54Ca+44.24 Cb.(2)(1)(2)式中的 D
21、665、D 649为叶绿素溶液在波长 665nm 和 649nm 时的光密度。Ca、C B为叶绿素 a、b 的浓度、单位为每升克数。82.04、9.27 为叶绿素 a、b 在、在波长 665nm 时的比吸收系数。16.75、45.6 为叶绿素 a、b 在、在波长 649nm 时的比吸收系数。解方程式(1)(2)，则得 ：CA=13.7 A665 - 5.76 A649(3)CB=25.8 A649 - 7.6 A665 (4)G=CA+CB=6.10 A665+20.04 A649(5)此时，G 为总叶绿素浓度，C A、C B为叶绿素 a、b 浓度，单位为每升毫克，利用上面（3）（4）（5）式
22、，即可以计算叶绿素 a、b 及总叶绿素的总含量。四、方法步骤1称取 0.1 克新鲜叶片，剪碎，放在研钵中，加入乙醇 10ml 共研磨成匀浆，再加 5ml 乙醇，过滤，最后将滤液用乙醇定容到 25ml。2取一光径为 1cm 的比色杯，注入上述的叶绿素乙醇溶液，另加乙醇注入另一同样规格的比色杯中，作为对照，在721 分光光度计下分别以 665nm 和 649nm 波长测出该色素液的光密度。计算结果：五、实验报告计算所测植物材料的叶绿素含量。实验九 离体叶绿体光还原反应一、实验目的了解光合作用在叶绿体中进行的光还原作用；熟悉离体叶绿体的提取方法二、仪器及药品离心机、分光光度计、烧杯、试管、移液管、提
23、取介质 50mmol/L（pH7.5）TrisHCl 缓冲液（内含 0.4mol/L 蔗糖、610mmol/LNaCl） ，0.3mol/L 2 . 6 - 二氯酚靛酚溶液（用上述提取介质配制）三、原理离体叶绿体能使 2 . 6二氯酚靛酚进行需光还原作用，使染料从蓝色变为无色，这些变化在 45 分钟内呈线性关系。其反应原理如下：四、方法步骤 1.离体叶绿体的提取 选取生长正常的菠菜叶子洗干净，用吸水纸擦干，去柄及粗脉，称 1 克叶子。将叶子剪碎放在研钵中，加入 10ml 提取介质及少量的石英砂，研磨成匀浆。 把匀浆倒在四层沙布中过滤至离心管中 1000 rpm 速度离心 3 分钟，弃沉淀，要上
24、清液。上清液在 3000 rpm 离心 5 分钟，弃上清液，沉淀即是叶绿体；将沉淀用提取介质使叶绿体悬浮。2. 叶绿体光还原反应的测定 取干净试管 3 支，按下表加入样品及其它试剂。管号 提取介质/ml 叶绿体悬液 /ml 煮沸 /min 染料/ml1 4.5 0.5 52 4.5 0.5 15 53 9.5 0.5 3.比色。将上面的各试管液分别倒入比色杯中，立即在分光光度计（波长 620 nm 下）进行测定，读出 A 值，然后将比色杯取出放在光下照光，每隔 1 min，再测定 A 值（以上设定步骤可进行 5 6 次） 。五、实验报告作出叶绿体对 2 . 6二氯酚靛酚的还原作用的曲线图。A
25、值为纵坐标，时间（min）为横坐标。实验十 苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的测定（3 学时）一、实验目的了解测定苯丙氨酸解氨酶活性的方法。二、实验原理 苯丙氨酸解氨酶（phenylalanineammonialyase，PAL）催化苯丙氨酸的脱氨反应，使 NH3 释放出来形成反式肉桂酸。此酶的在植物体内次生物质（如木质素等）代谢中起重要作用。根据其产物，反式肉桂酸在 290nm 处吸光度的变化可以测定该酶的活性。三、材料、仪器设备及试剂 （一）材料：马铃薯块茎 （二）仪器设备：1. 紫外分光光度计；2. 离心机；3.恒温水浴锅；4. 研钵。（三）试剂：1. 0.1mol/L 硼酸盐缓冲溶液（pH
26、8.8） ；2. 0.02mol/L 苯丙氨酸（用 0.1mol/L pH8.8 硼酸缓冲液配制） 。四、实验步骤 1. 酶粗提液的制备：称马铃薯 2g ,置于研钵中，加少许石英砂，少量 PVP（除去酚类物质，防止颜色的干扰） ，20ml 硼酸盐缓冲溶液，研磨匀浆，4，5000rpm 离心 15 分钟，上清液为酶粗提液。2. A 值测定： 1ml 酶液加 2ml0.02mol/L 苯丙氨酸，2ml 硼酸盐缓冲溶液，总体积为 5ml。对照以 1ml 硼酸盐缓冲溶液代替酶液；反应液置恒温水浴 40中保温，0.5h 后以 50l 盐酸终止反应。用紫外分光光度计在 290nm 处测定吸光度。以每小时在 290nm 处吸光度变化 0.01 所需酶量为一单位（相当每毫升反应混合物形成 1g肉桂酸） 。五、实验报告：根据下述公式计算酶活力。PAL 活性U/g FW.h7
