1、1.2 基因工程的基本操作程序,基因工程的基本操作流程,目的基因主要是指 编码蛋白质的结构基因,目的基因的获取,目前被广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、植物抗逆性基因（抗病毒、抗细菌)、人胰岛素基因等。,1）从基因文库中获取目的基因,2）利用PCR技术扩增目的基因3）人工合成,目的基因的获取方法,1）从基因文库中获取目的基因,基因文库的概念：,将含有某种生物不同基因的很多的DNA片段，导入到受体菌群中储存，每个受体菌含有这种生物不同的基因。,基因文库的分类,（1）构建基因组文库：将某种生物体内的DNA全部提取出来，选用适当的限制酶，将DNA切成一定大小的DNA片段，然后将这些片段分
2、别与载体连接起来，导入受体菌中储存，这个群体包含了这种生物的所有基因。,通过对受体菌的培养而储存基因,（2）构建cDNA文库,用某种生物发育的某个时期的mRNA反转录产生的多种互补DNA片段（也叫cDNA），与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个受体菌群体叫做这种生物cDNA文库。,cDNA合成过程,基因组文库和部分基因文库,原核细胞的基因结构,RNA聚合酶的作用是催化DNA转录为RNA。,真核细胞的基因结构,编码区是间隔的、不连续的。其中，能够编码蛋白质的序列叫做外显子，一般不能够编码蛋白质的序列叫做内含子。,信使RNA的加工：,成熟的信使RNA,转录,加工,初级转录物,剪切内含子转录部分
3、拼接外显子转录部分,真核生物基因表达的调控,如何从基因文库中得到我们所需的目的基因？,根据基因的有关信息：如基因核苷酸序列或表达的产物或基因的功能等等。（课本p9）,2）利用PCR技术扩增目的基因,原理: DNA双链复制前提: 要有一段已知目的基因的脱氧核苷酸序列，以便合成引物。,1. 加热至90-95度：DNA解链,氢键断裂； 2.冷却至55-60度：引物结合到互补DNA链； 3.加热至70-75度： Taq酶从引物起始进行互补链的合成,利用PCR技术扩增目的基因,3）人工合成如果基因比较小，核苷酸序列又已知，也可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。,基因表达载体的组成：,(二)基因表
4、达载体的构建, 核心,(三)将目的基因导入受体细胞,转化,目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,方法,导入植物细胞,导入动物细胞,导入微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法, 感受态细胞吸收DNA分子,(三)将目的基因导入受体细胞,1.农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物,植物体损伤分泌酚类化合物，吸引农杆菌。Ti质粒的T-DNA可转移至受体细胞的染色体DNA上.,将目的基因导入受体细胞（动物细胞）,显微注射法,2.微生物作受体细胞原因：,将目的基因导入微生物细胞,3.转化方法：,大肠杆菌,繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,处理细胞 细胞表达载体与感受态细胞混合 _细胞吸收DNA分子。,Ca2+,感受态,感受态,1.常用菌：,(四)目的基因的检测与鉴定,个体 鉴定：,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等, DNA分子杂交,分子杂交,抗原-抗体杂交,检测： 是否插入目的基因是否转录是否翻译,如果显示出杂交带，就表明待测样品含有目的基因或目的基因已经转录。,若不能表达，要对抗虫基因再进行修饰。,例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。,
