1、第四节 蛋白质杂交技术,检测DNA可用Southern印迹法 检测RNA可用Northern印迹法 检测蛋白质同样有蛋白质印迹法（Western印迹法） 蛋白质印迹是将蛋白质转移到固相支持物上，然后利用抗体与附着于固相支持物上的靶蛋白发生特异性的抗原抗体结合反应,一、原理,Western印迹有SDS-PAGE的高分辨力 固相免疫测定的高特异性和敏感性，可测出1ng5ng中等大小的蛋白质。 由于蛋白质的电泳分离几乎总是在变性的条件下进行，因此，不存在溶解、聚集以及靶蛋白与外来蛋白的共沉淀等问题。 还具有简便、标本可长期保存、结果便于比较等优点。,（一）蛋白提取试剂 1细胞裂解液 20mmol/L
2、 Tris(pH 7.5)150mmol/L NaCl1% Triton X-100 焦磷酸钠，-磷酸甘油，EDTA，正钒酸钠(Na3VO4)亮抑肽素等多种蛋白酶抑制剂,二、试剂,2蛋白上样缓冲液 100mmol/L TrisCl(pH 6.8) 200mmol/L二硫苏糖醇（DTT）4% SDS(十二烷基硫酸钠) 0.2% 溴酚蓝 20%甘油,（二）SDS-PAGE试剂 130%丙烯酰胺溶液 丙烯酰胺30g、双丙烯酰胺0.8g，溶于100ml水中，过滤后贮于褐色瓶中低温保存，可用一个月。 2Tris缓冲液 （1）1.5mol/L Tris(pH8.8)/积层胶缓冲液：Tris碱 18.17g
3、，用HCl调pH8.8，加水至100ml。 （2）1.0mol/L Tris(pH6.8)分离胶缓冲液：Tris碱 12.11g，用HCl调pH6.8，加水至100ml。,310% SDS 可用去离子水配成贮存液保存于室温。 410%过硫酸胺 过硫酸胺提供丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。 可用去离子水配制小量的贮存液并保存于4冰箱中。 由于过硫酸胺会缓慢分解，故应隔周重新配制。,5TEMED（N,N,N,N四甲基乙二胺） 通过催化过硫酸胺形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。 6Tris-甘氨酸电泳缓冲液 配成10贮存液备用，在900ml去离子水中溶解30g Tris碱和144g
4、甘氨酸，然后加入10g SDS，用HCl调pH至8.3，用去离子水补至1000ml。 使用前用去离子水稀释成1应用液。,（三）转膜缓冲液 39mmol/L 甘氨酸48mmol/L Tris碱0.037% SDS20% 甲醇,（四）染色液与脱色液 1考马斯亮蓝R250染液 100mg考马斯亮蓝R250溶于40ml 乙醇，加10ml冰醋酸，补水至100ml。 2考马斯亮蓝脱色液 40ml 乙醇，加10ml冰醋酸，补水至100ml。 3丽春红S贮存液 2g丽春红S，30g三氯乙酸，30g磺基水杨酸，加水至100ml。使用时，将1份上述贮存液加9份去离子水即为丽春红S应用液，使用后应废弃。,（五）封闭
5、液5脱脂奶粉 0.01% 防沫剂A 0.02%叠氮钠 溶于磷酸盐缓冲液（PBS）,（一）样品前处理 细菌一般直接用蛋白上样缓冲液裂解； 真核细胞或哺乳动物组织通常加细胞裂解液，机械或超声波室温匀浆0.5min1min。 4 10,000g13,000g离心5min，取上清 按照每4l蛋白样品加入1l 5蛋白上样缓冲液的比例混合。100水浴加热3min5min，以充分变性蛋白。 冷却到室温，上样到SDS-PAGE胶加样孔,三、实验方法,原理是根据大多数蛋白质都能与阳离子表面活性剂SDS按重量比结合成复合物 使蛋白质复合物所带的负电荷远远超过天然蛋白质分子所带的负电荷，消除了不同蛋白质分子的电荷效
6、应 蛋白质分子的迁移速率完全取决于分子量的大小，从而达到了分离不同分子量大小蛋白质的目的,（二）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,胶有效分离范围取决于用于灌胶的聚丙烯酰胺的浓度和交联度。 经双丙烯酰胺交联后丙烯酰胺凝胶的刚性和抗张强度都有所增加，形成的小孔必须能够允许SDS蛋白复合物通过 这些小孔的孔径随双丙烯酰胺、丙烯酰胺比率的增加而变小，比率接近1:20时孔径达到最小值。一般按双丙稀酰胺、丙烯酰胺为1:29配制,表1 SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围,1SDS聚丙烯酰胺凝胶的灌制（1）安装玻璃板（2）确定凝胶溶液体积，按所需丙烯酰胺浓度配制一定体积的分离胶溶液。依次混合各成分（见下表）一旦加入T
7、EMED，马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下步操作,表2 积层胶、分离胶所需溶液成分的配比,（3）迅速在两板的间隙灌注丙烯酰胺溶液，留出积层胶所需空间（梳子的齿长再加1cm）。然后小心的在丙烯酰胺溶液上加一层去离子水。凝胶垂直放置于室温下。 （4）分离胶聚合完全后（约30min），倾斜倒出覆盖的去离子水。 （5）配制5%积层胶。,（6）在已聚合的分离胶上直接灌注积层胶，立即在积层胶溶液中插入干净的梳子。小心避免混入气泡。 （7）积层胶聚合完全后（约30min），小心移出梳子。将凝胶固定于电泳装置上，上、下槽各加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。,2
8、上样和电泳取一定量样品与上样缓冲液混合后，加入上样孔。 将电泳槽与电源连接（正极应接下槽），凝胶上所加的电压为8伏/cm。当上样缓冲液中的染料前沿进入分离胶后，把电压提高到15伏/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部（约4h），然后关闭电源。 从电泳装置上卸下玻璃板，用刮勺撬开玻璃板，取下凝胶。,3考马斯亮蓝对SDS凝胶进行染色 考马斯亮蓝染色的主要目的包括： 显示靶蛋白在凝胶中的粗略位置，从而切去不含靶蛋白的凝胶，这样可以节省硝酸纤维素膜； 转膜后，凝胶染色可判断蛋白质转膜是否完全。,Western印迹的固相支持体有多种： 重氮苯硫醚（diazophenylthio, DPT）纸 重氮苄氧
9、甲基（diazobenzyloxymethyl, DBM）纸 溴化氰活化纸 氰尿酰氯纸 活化尼龙膜 目前最常用的是硝酸纤维素滤膜,（三）蛋白质从凝胶转移至固相支持体,蛋白质从凝胶转移至硝酸纤维素滤膜上：凝胶及与之相贴的硝酸纤维素滤膜夹于事先用转膜缓冲液浸泡过的Whatman 3MM滤纸之间 然后把结合体夹在石墨电极板之间，硝酸纤维素滤膜朝阳极一侧 蛋白质转移可用于室温进行，1.5h2h便可完成。,对硝酸纤维素膜上的蛋白进行染色 判断转膜是否完全 可供硝酸纤维素滤膜上的蛋白质进行染色的方法有很多种，但只有丽春红S染色法可与免疫学检测方法兼容，这是因为该染料只会短暂显色而且在进行Western印迹
10、时被洗去。,1封闭滤膜的蛋白结合位点：在加入一抗之前，必须封闭可能结合的位点以降低这类非特异性结合的背景。 封闭液常用脱脂奶粉 将硝酸纤维素滤膜放入自封袋中，根据滤膜面积以0.1ml/cm2的量加入封闭液 尽可能排除里面的气泡，然后封闭袋口，平放在平缓的摇床平台上室温温育1h2h PBS漂洗滤膜3次，每次10min。,（四）抗原抗体反应,2第一抗体和靶蛋白的结合 将抗体以适当的比例稀释 室温反应1h2h PBS漂洗滤膜3次，每次10min3加入第二抗体 加入适当稀释的二抗 室温反应1h2h PBS漂洗滤膜3次，每次10min,4显色 第二抗体通常是抗免疫球蛋白抗体或A蛋白 可用125I进行放射性标记 也可与辣根过氧化物酶共价偶联 与碱性磷酸酶共价偶联 由于放射性标记过程有时可导致抗体失活，因此更倾向于使用酶联标记的抗体。,谢 谢,
