1、植物基因转化受体系统,植物的基本特征,植 物,低 等 植 物,藻类 地衣,高 等 植 物,无根、茎、叶等分化器官,合子不经胚直接发育为个体,含根、茎、叶、花、果分化器官,合子经胚再发育为个体,苔藓门 蕨类门 裸子门 被子门,高等植物基因工程的基本概念,高等植物基因工程,高等植物细胞基因表达技术,高等植物转基因技术,转基因植株,植物工程细胞,农作物遗传性状改良,蛋白多肽物质大规模生产,小分子化合物大规模生产,高等植物基因工程的发展历程,1983 年 美国和比利时科学家首次将外源基因导入烟草和胡萝卜,1994 年 世界上第一种耐储藏的番茄在美国批准上市,1995 年 转基因的抗虫、抗除草剂的玉米和
2、棉花在美国投入生产,2000 年 美国转基因大豆的种植面积首次超过普通大豆,迄今为止 世界上共批准了12种作物、6大类性状的48个转基因品种进行商业化生产，其中包括水稻、玉米、马铃薯、小麦、黑麦、红薯、大豆、豌豆、棉花、向日葵、油菜、亚麻、甜菜、甘草、卷心菜、番茄、生菜、胡萝卜、黄瓜、芦笋、苜蓿、草莓、木瓜、猕猴,桃、越橘、茄子、梨、苹果、葡萄等。,高等植物的基因转移系统,Ti 质粒介导的整合转化程序,植物病毒介导的转染程序,植物细胞的直接转化程序,Ti 质粒介导的整合转化程序,几乎所有的双子叶植物尤其是豆科类植物的根部常常会形成根瘤，这是由于植物根部被一种革兰氏阴性土壤杆菌农杆根瘤菌（A.t
3、umefaciens）感染所致，其致瘤特性是由该菌细胞内的野生,Ti 质粒的结构与功能,型质粒 Ti（Tumor-inducing）介导的。,Ti 质粒的结构与功能,Ti 质粒的图谱,整个质粒 160 - 240 kb,其中 T-DNA 12 - 24 kb,tms 的编码产物负责：,合成吲哚乙酸,tmr 的编码产物负责：,合成植物分裂素,tmt 的编码产物负责：,合成氨基酸衍生物,冠瘿碱,Ti 质粒的结构与功能,Ti 质粒致瘤的分子机制,损伤的植物根部会分泌出乙酰丁香酸和羟基乙酰丁香酸，它们能诱导Ti质粒上的vir基因以及根瘤菌染色体上的一个操纵子表达。vir基因产物将Ti质粒上的T-DNA
4、单链切下，而根瘤菌染色体上的操纵子表达产物则与单链T-DNA结合形成复合物，后者转化植物根部细胞。,Ti 质粒的结构与功能,T-DNA的染色体整合机制,T-DNA的染色体整合机制,Ti 质粒的结构与功能,Ti 质粒的改造,除去T-DNA上的生长素（tms）和分裂素（tmr）生物合成基因，因为大量的生长素和分裂素会抑止细胞再生长为整株植物；,除去T-DNA上的有机碱生物合成基因（tmt）；因为有机碱的合成大量消耗精氨酸和谷氨酸，影响植物细胞的生长；,安装大肠杆菌复制子，使其能在大肠杆菌中复制，以利于克隆操作；,安装植物细胞的筛选标记，如 neor 基因，使用植物基因的启动子和polyA化信号序列
5、；,安装多聚人工接头以利于外源基因的克隆。,除去 Ti 质粒上的其它非必需序列，最大限度地缩短载体的长度；,共整合转化程序,二元整合转化程序,将外源基因克隆在大肠杆菌-农杆菌穿梭质粒的T-DNA区内；,重组质粒直接转化农杆菌株，该菌株携带只含vir区不含T-DNA区的Ti辅助质粒；,以上述重组农杆菌感染植物细胞。,植物病毒介导的转染程序,随着植物病毒分子生物学及遗传学研究的不断深入，用病毒基因组作为载体转化植物细胞日益受到人们的重视，因为病毒载体能将外源基因导入植物的所有组织和细胞中，而且不受单子叶或双子叶的限制。在大约300种特征清楚的植物病毒中，单链RNA病毒约占91%，双链RNA病毒、双
6、链DNA病毒、单链DNA病毒各占3%。利用植物病毒载体转化植物细胞大致有以下两种战略：,植物病毒介导的转染程序,以双链DNA病毒花椰菜花斑病毒（CaMV）基因组作为载体，去除有关的致病性基因，换上外源基因，体外包装成有感染力的病毒颗粒，转染植物细胞原生质体，并由此再生成整株植物。,转染植物细胞原生质体,植物病毒介导的转染程序,植物双生病毒（Geminiviruses）为一单链DNA病毒，成熟的双生病毒呈双颗粒状，每一个颗粒中含有一条不同的DNA单链。其中A链能单独在植物细胞中复制，并含有一部分病毒包衣蛋白基因；B链编码另一部分包衣蛋白基因及感染性基因。A、B两条链必须同处于一个植物细胞中，方能
7、形成有感染力的病毒。双生病毒具有广泛的宿主细胞范围，因此是一种很有潜力的植物病毒载体。,转染植物组织,转染植物组织,双生病毒家族成员蕃茄金花叶病毒（TGMV）克隆表达载体的构建程序,植物细胞的直接转化程序,枪击法,将待转化的DNA沉淀在细小金属珠的表面，用特制枪将金属珠直接打入植物细胞，枪的威力为430 m / s，植物细胞通常是胚胎细胞、玉米籽、叶子等，但进去的DNA片段整合效率极低。,电击法,将高浓度的质粒DNA加入到植物细胞的原生质体悬浮液中，混合物在 200 - 600 V / cm 的电场中处理若干秒钟，然后将原生质体在组织培养基中生长 1 - 2 周，再生出整株植物。,融合法,将外
8、源DNA与特殊的疏水性高分子化合物混合，在水中这些疏水性化合物分子形成球状的脂质体，后者与植物细胞原生质体融合，筛选融合子，再生植物细胞壁。,所有涉及到植物原生质体的基因转化方法均存在一个难题，即：原生质体很难再生出整株植物。,花粉管导入法,将外源DNA沿着花粉管经过珠心进入尚未形成正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞中，从而实现基因的转移。这一方法是我国科学家周光宇首先提出设计的，目前已应用于水稻、小麦、棉花、大豆、花生、蔬菜等作物的转基因研究，,花粉管导入法的特点是直接、简便。它的受体材料为植株整体，省略了细胞组织培养的诱导和传代过程，排除了植株再生的障碍，特别适合于难以建立有效再生系统的植
9、物。由于转化的是完整植株的卵细胞、受精卵或早期胚胎细胞，导入的DNA分子整合效率较高。,利用转基因植物生产功能蛋白和工业原料,利用植物生物反应器生产医用蛋白,利用植物生物反应器生产食品或饲料添加剂,利用植物生物反应器生产工业原料,利用转基因植物生产功能蛋白和工业原料,转基因植物作为生物反应器的优势如下：,植物易于生长，农田管理成本相对低廉，操作技术要求也不高,绝大多数植物的表达产物对人和牲畜无毒副作用，安全可靠,植物具有完整的真核表达修饰系统，利用转基因植物生产的重组蛋 白药物和疫苗在分子结构和生物活性上，与人体来源的蛋白质相似,利用植物生物反应器生产医用蛋白,借助于根瘤农杆菌介导的转化系统，
10、将小鼠抗体的轻链和重链编码基因分别置于两种烟草植物体内表达，然后两种重组植物品系进行杂交，产生的子代植物能同时合成小鼠的轻链和重链两种多肽。从这种转基因烟草的叶子里可检测到完整的抗体分子，含量为叶细胞蛋白总量的1.5%。实验结果表明，植物细胞的蛋白分泌系统能够有效识别小鼠抗体前体的信号肽序列。,转基因烟草表达小鼠抗体,转基因烟草表达小鼠抗体,利用植物生物反应器生产医用蛋白,人葡萄糖脑苷脂酶（hGC）是治疗高歇斯症（Gausher disease）遗传病的特效药，可能也称得上当今世界最昂贵的药物。每生产一个剂量的hGC要消耗 2000-8000 只人类胎盘，因此这种药物一直供不应求。美国VPI研
11、究机构的专家将克隆的hGC基因经改造导入到烟草中，并获得高效表达。在每克这种转基因烟草的新鲜叶片中，hGC的含量竟高达1mg，也就是说，从一株转基因烟草中就能产生出传统工艺需要消耗数千只胎盘才能获得的药物。,转基因烟草表达人葡萄糖脑苷脂酶,利用植物生物反应器生产食品或饲料添加剂,果聚糖是果糖的多聚体，可被人体肠胃中的微生物发酵，刺激双歧杆菌生长，释放短链脂肪酸进入循环系统，保健价值高。3-6聚体的果聚糖有甜味，是低能量的助甜剂，有助于降低体重，因此国际上果聚糖的销售量很大。荷兰科学家把果糖基转移酶基因导入烟草和马铃薯中，在获得的转基因植株中，果聚糖含量占8%（干重）以上，具有良好的开发前景。,
12、转基因烟草和马铃薯生产果聚糖,利用植物生物反应器生产食品或饲料添加剂,在许多植物的种子中，磷元素主要是以肌醇-6-磷酸（即植酸）的形式存在。单胃动物如猪和家禽几乎不能利用这些磷元素，因此必须在饲料中添加无机磷以满足动物营养的需要。在饲料中添加植酸酶则可以提高动物对植酸磷元素的利用率，减少动物粪便中磷酸盐含量，改善畜牧业发达地区磷酸盐富集化污染的程度。荷兰科学家从黑曲霉菌中克隆到植酸酶基因，并将之导入到烟草的种子中表达。在饲料中添加这种转基因烟草的种子便可达到良好的效果。,转基因烟草生产植酸酶,利用植物生物反应器生产工业原料,首批用于大规模生产并取得巨大经济效益的非食用性转基因植物产品是工业用油
13、，其中包括制造肥皂等去垢剂的十二碳月桂酸。油菜通常产生十八碳的不饱和脂肪酸，但只要在其体内表达另一个特殊的基因即可使转基因油菜改为合成月桂酸，并可使其含量提高到44%。此外，鉴于油菜植物易生长且产量高的特点，人们还致力于用它来生产其它工业用油，如可作润滑油和尼龙生产原料的芥酸以及用于麦淇淋制作的6-十八碳烯酸等。,转基因油菜生产肉桂酸,利用植物生物反应器生产工业原料,聚-b-羟基烷酸（PHAs）和聚羟基丁酸（PHB）两种结构相似的多聚体具有热塑性好、可被微生物完全分解的特性，因此被认为是最好的无污染性塑料原料。,转基因拟南芥生产聚羟基丁酸,将核细菌真养产碱菌的PHB生物合成基因导入拟南芥中，转
14、基因植物在整个生命周期中，PHB的含量逐步增加，并达到每克湿重植物产10毫克PHB的最大产量，大约相当于细胞干重的14%。,植物转基因技术在植物品种改良中的应用,控制果实成熟的转基因植物,抗病虫害的转基因植物,抗除草剂的转基因植物,改变花卉形状和颜色的转基因植物,抗环境压力的转基因植物,产高品质产物的转基因植物,控制果实成熟的转基因植物,蔬菜和水果成熟后，其组织呼吸速度和乙烯合成速度普遍加快，并迅速导致果实皱缩和腐烂。控制蔬菜水果细胞中乙烯合成的速度，能有效延长果实的成熟状态及存放期，为长途运输提供了有利条件，具有重要的经济价值。,植物细胞中的乙烯由S-腺苷甲硫氨酸经氨基环丙烷羧酸合成酶ACC
15、和乙烯合成酶EFE催化裂解而成。科学家采用反义RNA技术封闭番茄细胞中上述两个酶编码基因的表达，由此构建出的重组番茄的乙烯合成量分别仅为野生植物的3%和0.5%，明显增长了番茄的保存期。,控制果实成熟的转基因植物,植物体内乙烯的生物合成机制,抗病虫害的转基因植物,昆虫对农作物的危害极大，全世界每年因此损失数千亿美元。目前对付昆虫的主要武器仍是化学杀虫剂，它不但严重污染环境，而且还诱使害虫产生相应的抗性。将抗虫基因导入农作物是植物基因工程的得意之笔，能避免化学杀虫剂所造成的许多负面影响。目前，抗虫作物已占全球转基因作物的22。用于构建抗虫害转基因植物常见的外源基因有苏云金芽孢杆菌的毒晶蛋白基因、
16、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、凝集素基因、脂肪氧化酶基因、几丁质酶基因、蝎毒素、蜘蛛毒素基因等40多个，其中毒晶蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因和凝集素基因应用最为广泛。,细菌毒素蛋白编码基因的植物转基因程序,抗除草剂的转基因植物,在大田里，尽管每年花费上百亿美元使用100多种化学除草剂，但杂草的生长仍使农作物减产10%。目前使用的除草剂特异性不强，或多或少会影响农作物的生长。利用转基因技术构建抗除草剂的重组植物可望解决这一问题，其战略包括：,抑制农作物对除草剂的吸收,高效表达农作物体内对除草剂敏感的靶蛋白,降低敏感性靶蛋白对除草剂分子的亲和性,向农作物体内导入除草剂的代谢灭活能力,抗环境压力
17、的转基因植物,长期的植物生理学研究结果表明，植物对盐、碱、旱、寒、热等环境不利因素的自我调节能力很大程度上取决于细胞内的渗透压，提高渗透压往往能改善植物对上述环境不利因素的耐性。为达到此目的至少有两种战略可供选择：一是高效表达能提高植物胞内渗透压的同源或异源蛋白；二是借助于蛋白质工程技术改变植物细胞内丰度较高的蛋白质的氨基酸组成，如在不影响蛋白质结构与功能的前提下适当提高脯氨酸残基的含量等。,产高品质产物的转基因植物,植物油大都是含有双键的不饱和脂肪酸，故在室温下呈液态。人造黄油的制作是通过催化加氢使植物油熔点上升，这种工艺不但加工成本很高，而且还会导致顺式双键转变为对健康不利的反式双键。利用
18、反义RNA技术，特异性灭活植物体内硬脂酰-ACP脱饱和酶的编码基因，即可提高转基因油料作物中饱和脂肪酸的含量。,将不饱和脂肪酸转化为饱和脂肪酸,产高品质产物的转基因植物,一般粮食种子的储存蛋白中几种必需氨基酸的含量较低，例如禾谷类蛋白的赖氨酸含量低，豆类植物的蛋氨酸、胱氨酸、半胱氨酸含量低，直接影响到人类主食的营养价值。将蚕豆中一种富含赖氨酸和甲硫氨酸的蛋白编码基因植入玉米中，可显著提高其营养价值。马铃薯和水稻的类似改良也在进行之中。,提高粮食中必需氨基酸的含量,产高品质产物的转基因植物,目前全世界有24亿人以大米为主食，约有1.3亿人因缺铁而引起贫血，2.5-10亿人患有不同程度的维生素A缺
19、乏症。为了增加稻米中的铁质含量，从大豆芽中分离出铁蛋白编码基因，将之转入亚洲稻谷一个普通品系中。结果发现，转基因稻谷能储存相当于普通稻谷3倍的铁质研究还发现，普通稻米中含有一种植物酸，阻碍人的消化系统对铁的吸收。瑞士科学家将来自水仙等植物的相关基因植入水稻中，不仅铁的含量有所提高，而且维生素A的含量也丰富了。,提高粮食中铁元素和维生素的含量,改变花卉形状和颜色的转基因植物,花卉的颜色是由花冠中的色素成分决定的。大多数花卉的色素为黄酮类物质，由苯丙氨酸通过一系列的酶促反应合成，而颜色主要取决于色素分子侧链取代基团的性质和结构，如花青素衍生物呈红色，翠雀素衍生物呈蓝色等。在黄酮类色素的生物合成途径
20、中，苯基苯乙烯酮合成酶（CHS）是一个关键酶。利用反义RNA技术可有效抑制矮牵牛花属植物细胞内的CHS基因表达，使转基因植物花冠的颜色由野生型的紫红色变成了白色，并且对CHS基因表达抑制程度的差异还可产生一系列中间类型的花色。,改变花卉的颜色,改变花卉形状和颜色的转基因植物,植物激素在控制花朵的形状和大小方面起着重要的作用。例如，细胞分裂素与植物生长素的比值可以决定植株包括花的形状。分子生物学和遗传学的研究都表明，同源异形基因表达的加强或减弱都会改变花的大小和形状，而这些基因的表达时间直接影响到植物的花期。同源异形基因控制花形的过程十分保守，在几乎所有的观赏花卉中都是一样的，这就为人们用基因工
21、程的方法改变花形和花期提供了有利条件。,改变花卉的形状,植物基因转化受体系统,植物基因转化受体系统的条件 植物基因转化受体系统的类型及特性 植物基因转化受体系统的建立 植物基因转化受体系统常见的问题及其解决途径,植物基因转化受体系统的概念,植物基因转化受体（gene transformation receptor）系统一般是指用于转化的外植体通过组织培养途径或其他非组织培养途径，能高效、稳定地再生无性系，并能接受外源基因（foreign gene)的整合（recombination），对用于转化选择的抗生素敏感的再生系统。,高效稳定的再生能力 较高的遗传稳定性 具有稳定的外植体来源 抗生素敏感
22、性 农杆菌敏感性,植物基因转化受体系统的条件,一、高效稳定的再生能力,用于植物基因转化的外植体必须易于再生，有很高的再生频率，并且具有良好的实验稳定性和重复性。 不同植物的种类、细胞类型、细胞状态、特定的植物培养技术的成熟程度等在建立受体系统时均需考虑。,二、较高的遗传稳定性,植物受体系统接受外源DNA后不影响其自身的遗传体系，同时又能稳定地将外源基因遗传给后代，保持遗传的稳定性。 选择适当的培养体系。,三、具有稳定的外植体来源,转化的外植体一般采用种子，无菌实生苗的胚轴、子叶或幼叶，可进行离体快速繁殖的材料如一些植物的试管苗，以及可较高频率诱导的营养变态器官等。,四、抗生素敏感性,植物基因转
23、化中，通常使用两类抗生素： 抑菌抗生素 选择性抗生素 选择性抗生素应满足以下条件： 植物受体材料对所选用的抗生素有一定的敏感性； 抗生素对受体植物没有剧烈的毒性。,五、农杆菌敏感性,对于利用农杆菌Ti或Ri质粒为载体所介导的植物基因转化而言，需要植物受体材料对农杆菌敏感。,植物基因转化受体系统的类型及特性,经过愈伤组织的受体系统 不经过愈伤组织的受体系统 原生质体再生系统 细胞系及其体细胞胚受体系统 生殖细胞受体系统,经过愈伤组织的受体系统,经过愈伤组织的受体系统是指外植体经脱分化培养诱导愈伤组织，并通过分化培养获得再生植株的受体系统。,农杆菌直接侵染外植体,培养形成愈伤组织,分化成植株,外植
24、体诱导形成愈伤组织,愈伤组织转化外源基因,再生植株,特点： 外植体来源广泛； 扩繁量大； 适用的植物范围广； 嵌合体多； 遗传稳定性差。,注意事项,取材：常采用叶片、茎段、子叶、上胚轴等。 受体细胞对农杆菌的感受态。,不经过愈伤组织的受体系统,不经过愈伤组织的受体系统也称直接分化再生系统，是指外植体细胞越过脱分化阶段，直接分化出不定芽，从而获得再生植株的受体系统。 取材：从组织类型上讲，叶片、幼茎、子叶、胚轴以及一些营养变态器官较易诱导直接分化；从细胞状态讲，薄壁细胞较为合适。,特点： 获得再生植株的周期短，操作简单； 可较好维持受体植物的遗传特征； 转化的外源基因能稳定遗传； 嵌合体多； 转
25、化频率较低。,原生质体再生系统,原生质体是“裸露”的植物细胞，能直接高效地摄取外源基因，因而转化效率高且合适于现在建立的所有转化方法。 原生质体再生系统通常处于相对均匀和稳定的控制环境中，从理论上说，有利于准确的转化和鉴定。 通过原生质体培养，细胞分裂形成基因型一致的细胞克隆，因此再生植株的嵌合体少。 原生质体培养周期长，培养技术限制该系统的应用。,植物原生质体的再生程序,原生质体的再生效率在植物转基因技术中至关重要。标准的高等植物原生质体制备和再生程序是：将植物嫩叶、幼芽或愈伤组织切成碎片，浸入含有纤维素酶的缓冲液中保温；悬浮物离心除细胞碎片；将原生体悬浮液滴在无菌滤纸片上，并置于含有普通植
26、物细胞（即所谓的滋养细胞）的固体再生培养基的表面，使原生质体与滋养细胞不直接接触，但可吸收由滋养细胞分泌扩散出来的植物生长因子及其它化合物；培养2-3周后，将滤纸上的植物细胞蔟转移至含有高浓度分裂素和低浓度生长素的固体培养基上继续培育2-4周，滤纸片上便长出嫩芽；将嫩芽置入含有低浓度生长素而无分裂素的固体培养基上，使其根部发育；大约3周后再将之移植在土壤中，长成整株植物。,植物原生质体的再生程序,细胞系及其体细胞胚受体系统,通过筛选和优化的植物细胞悬浮培养的细胞系，通常具有较好的遗传和生理状态的一致性，通过一定的培养基调节，可使细胞进入胚性状态进而形成体细胞胚。 该系统培养技术比原生质体容易，
27、转化效率又优于其他组织培养系统，因此被认为是最理想的基因转化受体系统。,特点： 胚性细胞繁殖量大，同步性好，是理想的基因转化感受态细胞，转化效率高； 转化获得的转基因植株嵌合体少； 体细胞胚具有两极性，减少了不定芽发育途径中的生根培养过程； 获得的后代个体间遗传背景一致，无性系变异小。,生殖细胞受体系统,生殖细胞受体系统指的是以生殖细胞如花粉粒和卵细胞为受体细胞进行基因转化的系统。 两条途径： 利用小孢子和卵细胞的单倍体培养，诱导出胚性细胞或愈伤组织，建立单倍体的基因转化受体系统； 直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化。,植物基因转化受体系统的建立,外植体具有诱导callus和再生植株的能
28、力；芽的分化率高；易培养；体细胞无性系变异小。,对农杆菌介导的基因转化系统而言,外植体的选择,外植体生理年龄 外植体细胞生理状态 外植体的遗传背景 外植体的选择与受体系统相匹配,培养基选择,植物的营养特性 激素的选择,受体系统常见的问题及其解决途径,再生能力及其遗传稳定性 愈伤组织的褐化 再生植株玻璃化,再生能力及其遗传稳定性,再生能力下降的解决途径： 减少筛选继代次数； 选用合适的外植体，采用最适培养基。 减少变异性的措施： 减少组织培养时间，甚至完全取消组织培养过程。 比如用基因伧轰击胚轴或芽的分生组织，收获种子，在后代中筛选转化植株。,愈伤组织的褐化,愈伤组织褐化是由于植物体内含有较多的
29、酚类化合物，其在多酚氧化酶的作用下，氧化成为褐色的酚类物质和水，酚类物质又会在酪氨酸酶的作用下，使蛋白质聚合，生长停顿，最终导致死亡。,防止褐变的措施： 选择适宜的外植体 缩短转瓶时间 在培养基中添加抗氧化剂，如：Vc、聚乙烯吡咯烷酮、柠檬酸、硫代硫酸钠、二硫苏糖醇、谷光甘肽等。 在培养基中添加吸附剂，如0.010.1%活性炭。,再生植株玻璃化,玻璃化再生植株指的是半透明状、畸形的植物，不能移栽成活。原因可能与培养物渗透势不适当有关，是植物对培养基水分状态不适应的一种生理表现。,防治措施： 适当提高培养基中蔗糖含量或加入渗透剂，降低培养基中的渗透势，降低培养瓶内部环境的相对湿度； 适当降低培养基中的细胞分裂素和GA的浓度，适当增加培养基中的一些矿质元素，如:Fe、Cu、Mn、Ca、K、P等； 增加自然光照，改善培养器皿的气体交换状况等。,影响受体系统转化效率的因素,农杆菌菌株（菌株类型、侵染活力） Vir基因活化的诱导物（酚类化合物、单糖或糖酸、氨基酸、磷酸饥饿、低pH等因素） 外植体的类型和生理状态 外植体的预培养 外植体的接种及共培养 转化细胞的选择培养和转化植株再生,
