1、凝胶层析法分离血红蛋白 和溴酚蓝,【目的】,掌握凝胶层析的基本原理 学习利用凝胶层析法分离生物大分子和小分子的实验技能,【原理】,凝胶层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离的技术。,凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术，又称之凝胶过滤、分子筛层析或排阻层析。单个凝胶珠本身象“筛子”。不同类型凝胶的筛孔的大小不同。,凝胶层析,带网孔的葡聚糖珠,小分子进入葡聚糖珠内,大分子不能进入珠内，经珠之间缝隙流出,凝胶层析过程示意图,凝胶层析过程示意图,小分子,大分子,凝胶基质,凝胶珠,总结： 相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶
2、网孔被完全排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此流程较短，移动速度快；所以首先流出。 相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可完全渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此流程较长，移动速率慢；所以最后流出。 中等大小的分子，它们在凝胶颗粒内外部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间，这样分子大的组分先流出，分子小的组分后流出。这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。,【实验器材】,层析柱 洗脱装置 试管等普通玻璃器皿,【实验试剂】,待分离样品：1。鸡血红蛋白：取新鲜抗凝全血5ml，于2000r/
3、min离心10min，弃血浆，用三倍于血球体积的0.9Nacl溶液洗血球（颠倒混匀）。离心弃去上清液，重复12次，至上清液清亮为止。于血球中加入10倍体积的蒸馏水，混匀，使血球破碎，过滤，即得血红蛋白溶液。2。 1mg/ml溴酚蓝溶液 (待分离样品老师已准备好) 葡聚糖凝胶 Sephadex G-25 洗脱液：0.2mol/L NaCl缓冲液,【操作方法】,一、凝胶的处理Sephadex G-25干粉置于蒸馏水中室温下溶胀3h，沸水浴加热，再用蒸馏水洗涤几次，将不易沉降的细小颗粒随水倾倒（以免在装柱后产生阻塞现象，降低流速）。洗涤后将凝胶浸泡在洗脱液中待用。 （凝胶已处理）,二、装柱 A, 将
4、层析柱垂直固定在铁架台上，关闭出口，向柱内加入洗脱液约1cm高，若不漏则证明柱完好。 B,将溶胀好的凝胶放在烧杯中，使凝胶表面的水层与凝胶体积相等；用玻璃棒搅匀凝胶液，顺玻璃棒灌入柱内，此时柱下口一边排水，上口一边加入搅匀的凝胶，可见凝胶连续均匀地沉降，逐步形成凝胶柱； C,当到达所需凝胶高度时，立即关闭下口，使凝胶完全沉降； D,凝胶柱上始终覆盖一层溶液，凝胶柱用洗脱液流过。,装柱注意事项： （1）装柱前加入1cm洗脱液，检查柱子 （2）凝胶装柱要一次完成。 （3）柱中的凝胶一定要浸没在洗脱液中。 （4）装凝胶的烧杯不能清洗。（看似脏的东西都是凝胶）。,三、加样与洗脱先打开下口开关，放出凝胶
5、柱面上的溶液（或吸取，但溶液面不能低于凝胶表面），然后加样，控制流速，使样品渗入凝胶内。本实验样品为：血红蛋白和溴酚蓝混合样品0.75mL(血红蛋白：溴酚蓝=2:1），用移液管滴加在液面下（不能冲起凝胶柱，也不能沿管壁流下），样品下渗至凝胶面时，关闭下口，完成上样，再加一层洗脱液（35cm）。调整洗脱装置使滴入洗脱液滴速率与流出液滴速率一致。,四、收集用试管收集洗脱液。 五、凝胶柱的处理凝胶用过后，用洗脱液通过柱（23倍床体积）即可。 注意：需回收！,注意事项,始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发，凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动，导致分离效果变坏，不得不重新装柱。,思考题,一、为什么溴酚蓝能与血红蛋白在层析柱中能够很好的分开？ 二、生化实验中常用的凝胶有哪些？各有何特征？,
