1、植物生态学报 2010, 34 (7): 876888 doi: 10.3773/j.issn.1005-264x.2010.07.013 Chinese Journal of Plant Ecology http:/www.plant- 收稿日期Received: 2009-08-18 接受日期Accepted: 2010-03-30 * E-mail: 豆科植物共生结瘤的分子基础和调控研究进展 丑敏霞1*魏新元2 1西北农林科技大学生命科学学院, 陕西杨凌 712100; 2西北农林科技大学食品科学与工程学院, 陕西杨凌 712100 摘 要 豆科植物与根瘤菌共生互作的结果导致了一个新的
2、植物器官根瘤的形成, 根瘤菌生活在根瘤中, 它们具有将氮气转化为能被植物同化的氨的能力。该文阐述了根瘤的形成过程和类型, 并主要以模式豆科植物蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)和日本百脉根(Lotus japonicus)为例, 对近年来共生结瘤过程中宿主植物对根瘤菌结瘤因子的识别和信号传递、侵入线形成和固氮的分子基础, 以及宿主植物对根瘤形成的自主调控机制、环境中氮素营养对结瘤的影响研究进行了综述, 指出当前豆科植物与根瘤菌共生互作研究存在的问题, 并对今后的研究方向作了分析与展望。 关键词 豆科植物, 根瘤形成, 结瘤素基因, 信号传递, 共生固氮 Review of re
3、search advancements on the molecular basis and regulation of symbiotic nodulation of legumes CHOU Min-Xia1*and WEI Xin-Yuan21College of Life Sciences, Northwest Sci-Tech University of Agriculture and Forestry, Yangling, Shaanxi 712100, China; and 2College of Food Science and Engineering, Northwest S
4、ci-Tech University of Agriculture and Forestry, Yangling, Shaanxi 712100, China Abstract The symbiosis between leguminous plants and rhizobia leads to the formation of a novel root organ, the nodule. In mature nodules, rhizobia provide the host plant with ammonium, which is produced through bacteria
5、l nitrogen fixation. The symbiotic interactions involve the perception of bacterial signaling factors called Nod factors (NFs) by plant host, the NF signaling pathway, the formation of infection threads and the development of nodule in the cortex. Although this nodule formation is beneficial for hos
6、t plants to secure a nitrogen resource, overproduction of nodules could deleteriously affect plant growth. Legume plants avoid this by utilizing a negative feedback regulation known as autoregulation of nodulation (AON), in which earlier formed nodules suppress further nodulation through shoot-root
7、communication. We summarize nodule formation and types and highlight recent studies on the molecular basis underlying NF signaling cascade, AON and effects of environmental nitrogen conditions on nodulation. We also discuss current research problems and reflect on the future of this field. Key words
8、 legumes, nodule formation, nodulin genes, signaling, symbiotic nitrogen fixation 空气中约含80%的氮气, 因其化学惰性而无法被高等生物直接利用。只有固氮微生物具有将氮气转化为能被植物同化的氨的能力, 此即为生物固氮。据联合国粮农组织(FAO) 1995年粗略估计, 全球每年由生物固定的氮量已近2 1011 kg (相当于4 1011 kg尿素), 约占全球植物需氮量的3/4。所以, 生物固氮是地球上最大规模的天然氮肥加工厂。 根据固氮微生物与其他生物的关系, 可将生物固氮系统分为自生固氮、联合固氮和共生固氮3种
9、不同的体系。其中, 共生固氮体系是自然界中主要的固氮体系, 包括根瘤菌与豆科植物、弗兰克氏菌与非豆科植物、固氮蓝细菌与植物(如满江红(Azolla imbricata)、苏铁(Cycas revoluta)和根乃拉草(Gunnera tinctoria), 以及蓝细菌与真菌的地衣共生体等, 这一体系具有根瘤等特殊的共生结构, 固氮效率极高, 因而始终是生物固氮研究的焦点之一, 其中尤以豆科植物的共生固氮最为突出。世界上有豆科植物约19 700种, 其中已知可以结瘤固氮的有2 800多种, 占15% (Dnari 许多结瘤素基因从不同豆科植物中被分离筛选, 部分基因的功能得以阐明; 围绕模式植物
10、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)和日本百脉根(Lotus japonicus)进行的结构、比较、功能基因组学及蛋白质组学的研究正如火如荼地展开。本文主要以蒺藜苜蓿和日本百脉根的各种突变株为例, 对近年来豆科植物在共生固氮方面特别是共生结瘤过程中的信号传导研究进展进行了综述, 并对当前存在的问题和以后的研究方向作了分析与展望, 以期为豆科植物与根瘤菌的共生互作研究提供参考。 1 根瘤的形成与类型 豆科植物可以与土壤中的根瘤菌属(Rhizo- bium)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、中慢生根瘤菌属(Mesorhi- z
11、obium)及固氮根瘤菌属(Azorhizobium)等根瘤菌共生结瘤, 这些共生的革兰氏阴性菌伙伴被统称为根瘤菌, 它们之间的共生互作起始于共生双方的分子对话。首先, 植物分泌类黄酮至根际, 诱导根瘤菌结瘤基因的表达并合成结瘤因子(Nod factor, NF)。这些结瘤因子是一些脂壳寡糖(lipochitooligosaccharides, LCOs), 它们被植物特异性地识别后, 植物的根迅速作出一系列反应, 如钙峰及离子流(Ca2+、Cl、H+)的形成、根毛顶端膨胀和新的顶端生长、根毛分枝和卷曲(Dnari et al., 1996; Crdenas et al., 2000; Sha
12、w van Spronsen et al., 1994; Brewin, 1998)。 结瘤因子主要由35个-1, 4糖苷键连接的乙酰氨基葡萄糖寡聚体骨架和非还原端脂肪酸链组成, 其侧链上羟基的取代基团、脂酰链的长度及不饱和度决定着NF的活性和特异性, 并与根瘤菌的宿主专一性紧密相关。有效的共生侵入需要特殊取代基团的存在, 但这些取代基团并非对NF诱导的所有反应都是必需的。例如, 在蒺藜苜蓿与中华根瘤菌的共生互作中, 侵入线的形成严格要求结瘤因子葡糖胺骨架非还原端具有乙酰基, 但钙峰形成、一些特异基因的转录及根瘤原基的发生则没有这样严格的要求(Ardourel et al., 1994; Ol
13、droyd et al., 2001; Wais et al., 2002)。因此, 有人提出了在Medicago中NF存在两类受体: 信号受体与进入受体, 前者是诱导结瘤过程早期反应所必需的, 后者则介导着根瘤菌在根表皮中的侵入过程, 对NF的结构有着更严格的要求(Ardourel et al., 1994)。 从结构上看, 根瘤一般可分为定型根瘤和不定型根瘤(图1)。前者主要在热带豆科植物如大豆(Glycine max)、豇豆(Vigna unguiculata)等的根上形成, 这类根瘤只在发育早期出现细胞分裂, 随后只进行细胞的伸长生长。在成熟的根瘤内, 包含固氮细胞的中央组织是均一的。
14、不定型根瘤则通常形成于温带豆科植物上, 如蒺藜苜蓿、豌豆(Pisum sa-tivum)、蚕豆(Vicia faba)及白花三叶草(Trifolium repens)等, 它们具有明显的分层: I层为顶端分生组织; II层为含有根瘤菌的侵染区; 然后是富含淀粉粒的II-III中间带, 主要的转录变化即发生于此; III层为固氮区, 其中充满能固氮的类菌体; 最后是接近衰老的IV层(Vasse et al., 1990; Brewin, 1991; Hirsch, 1992)。要注意的是, 日本百脉根虽然和蒺藜苜蓿同属于温带豆科植物, 但却形成定型根瘤。 实际上, 定型根瘤与不定型根瘤的区别不仅
15、表现在结构上, 在发育早期, 它们就已经显示了不同: 不定型根瘤的根瘤原基形成于内皮层, 而定型根瘤的根瘤原基形成于外皮层; 不定型根瘤早期伴随有胞质桥的发生, 而定型根瘤则不一定, 如菜豆(Phaseolus vulgaris)就不像日本百脉根一样形成胞质桥(van Spronsen et al., 2001)。另外, 类菌体在不 878 植物生态学报Chinese Journal of Plant Ecology 2010, 34 (7): 876888 www.plant- 图1 定型根瘤与不定型根瘤示意图。A, 不定型根瘤结构模式图。B, 紫云英不定型根瘤纵切图。C, 大豆定型根瘤纵切
16、图。A和B来自Naito等(2000), C由华中农业大学农业微生物学国家重点实验室生物固氮研究室提供。 Fig. 1 Diagram of the determinate- and indeterminate-type nodule. A, Schematic representation of the five distinct regions of an in-determinate type nodule. B, The vertical dissection of an indeterminate type nodule of Astragalus sinicus. C, The v
17、ertical dissection of a determinate type nodule of soybean. A and B are derived from Naito et al., 2000; C is provided by the laboratory of Biological Nitrogen Fixation, State Key Laboratory of Agricultural Microbiology, Huazhong Agricultural University, Wuhan, China. 同类型根瘤中的形成与代谢也各异。在定型根瘤中, 共生体间可以相
18、互融合, 或者同一共生体中的类菌体进一步分裂, 结果形成几个类菌体共存于一个共生体中的局面; 而在不定型根瘤中, 单个的共生体连同类菌体一起分裂, 结果更多地是一个共生体中只包含一个类菌体(Prell 同时, 以不产PHB的根瘤菌突变体接种豌豆, 其不定型根瘤中的类菌体在发育过程中消耗了更多的植物淀粉(Lodwig et al., 2005), 表明PHB在类菌体形成中作为碳源和能源被利用, 分解代谢的急剧增强导致了PHB的消耗。但在定型根瘤中, 即使是成熟的类菌体, 仍然继续积累着大量的PHB。类菌体固定形成的NH4+进入植物细胞后, 在许多豆科植物特别是结不定型根瘤的植物细胞中, NH4+
19、被结合形成谷氨酰胺或天冬酰胺, 而在热带结定型根瘤的豆科植物中, NH4+被结合为酰脲(Lodwig 后者则在发育完全的、成熟的根瘤中表达, 与根瘤的功能有关, 包括一些参与初级代谢的酶、维持根瘤完整结构的蛋白质等, 其中研究得较为清楚的是豆血红蛋白基因(Nap Shaw An et al., 2004)。DMI1由氨基端序列介导定位于蒺藜苜蓿根及根瘤细胞的核膜上, 羧基端包含一个钾离子电导率调控蛋白结构域(RCK), 与产甲烷杆菌中的钾离子通道蛋白(MthK)有着高度的相似性, 包括RCK在内的羧基端缺失突变明显干扰了根瘤的形成, 并使得G蛋白拮抗物胡蜂蜂毒素诱导的钙峰不能形成。研究者们认为
20、, DMI1并没有直接参与结瘤因子诱导的钙离子变化, 而是调控着钙离子通道蛋白(Riely et al., 2007; Peiter et al., 2007)。DMI1在日本百脉根中有两个同源蛋白质: POLLUX和CASTOR, 它们的突变株虽能发生根毛分枝与变形, 但不发生根毛卷曲, 也不能形成侵入线; 与DMI1不同, POLLUX和CASTOR定位于质体上, Imaizumi-Anraku等(2005)推测它们可能形成复合物, 调节钙离子流穿过质体膜。近年的研究表明, POLLUX和CASTOR也为另一更古老的共生体系植物与真菌的共生互作所需, 在豆科植物和非豆科植物中广泛存在且高度
21、保守(Banba et al., 2008; Chen et al., 2009)。DMI2编码一个含有重复的亮氨酸丰富结构域的类受体激酶(LRR-RLK), 定位于质膜和侵入线膜上(Endre et al., 2002; Limpens et al., 2005), 它的同源物有: 来自日本百脉根和田菁(Sesbania cannabina)的SYMRK (symbiosis receptor kinase; Stracke et al., 2002; Capoen et al., 2005)、紫花苜蓿(Medicago sativa)的NORK (nodulation recep-tor
22、kinase; Endre et al., 2002)和豌豆的SYM19 (Stracke et al., 2002)。dmi3编码钙离子/钙调素依赖的蛋白激酶(CCaMK) (Lvy et al., 2004), 日本百脉根中与其同源的基因为SNF1 (spontaneous nodule formation 1)。CCaMK含有一个自抑制结构域, 在与钙调素结合后自抑制结构域释放, 使得CCaMK的激酶活性得以表达, 从而激活根瘤的形态发生过程。和dmi1、dmi2一样, dmi3不能共生结瘤, 但该突变株能形成钙峰。在不接种根瘤菌的情况下, 自激活的CCaMK能诱导早期结瘤素基因ENOD
23、11的表达, 并在植株上形成根瘤(Gleason et al., 2006; Tirichine et al., 2006)。除了负责转换钙峰信号以外, DMI3还可能通过磷酸化的方式控制NSP1的表达(Smit et al., 2005)。 nsp1、nsp2 (nodulation signaling pathway 2)具有和dmi3类似的突变表型, 遗传学分析表明, 它们位于dmi3的下游, 编码属于GRAS家族的蛋白质(Kal et al., 2005; Smit et al., 2005)。GRAS结构域包含两个亮氨酸丰富区和一些小的稳定的保守序列, 如VHIID、PFYRE和SA
24、W, 这个家族的成员与植物赤霉素和光敏色素的信号传导有关, 推测是一些转录调控因子。NSP1、DMI3均定位于根表皮细胞和皮层细胞的细胞核上(Smit et al., 2005), NSP2则定位在核膜和内质网上(Kal et al., 2005)。研究表明, 蒺藜苜蓿经结瘤因子处理后, 一些早期结瘤素基因迅速表达, 其中包括ENOD11。自激活的CCaMK也能诱导ENOD11的表达, 同时还需要NSP1、NSP2及ERN1等基因参与调控(Gleason et al., 2006; Tirichine et al., 2006; Middleton et al., 2007), 表明CCaMK
25、传递的钙信号正是通过上述NSP1、NSP2、ERN (ERF required for nodulation)等转录调控因子激活了靶基因的表达。ERN1及其同源蛋白ERN2、ERN3直接作用于ENOD11的启动子, 其中, ERN1和ERN2为转录激活物, 而ERN3则起抑制作用(Andriankaja et al., 2007)。最近的研究证实, 在体外, NSP1可直接结合于ENOD11、ERN1、NIN等早期结瘤素基因的启动子部位, 表明这些基因的诱导需要NSP1; 而在体内, NSP1与ENOD11启动子的相互作用还需要NSP2, 亦即以NSP1-NSP2异源多聚体的形式与之结合(Hi
26、rsch et al., 2009)。ERN类调控因子和NSP1与ENOD11启动子之间的结合位点仅相距26 bp, 推测这两类蛋白质之间可能存在着一定的相互作用。可见, 在NF信号传导途径中, 钙离子作为第二信使, 负责着宿主细胞质膜对根瘤菌NF的识别到细胞核中基因的表达变化之间的信号链接。 与ERN一样, EFD (ERF required for nodule dif-ferentiation)也属于乙烯响应因子群V (ethylene re-sponse factor group V, ERF V)的转录因子, 但是, EFD的氨基酸序列及表达方式均明显有别于ERN蛋880 植物生态学
27、报Chinese Journal of Plant Ecology 2010, 34 (7): 876888 www.plant- 白质(Verni et al., 2008)。研究表明, EFD负调控着根瘤菌引起的侵染结瘤, 并为有固氮功能的根瘤形成所必需; 另外, EFD激活了细胞分裂素的初级受体基因Mt RR4的表达, 可能因而阻遏了细胞分裂素信号传递过程, 结果抑制了新的根瘤起始, 却促进了已起始根瘤分生组织细胞的分化(Verni et al., 2008)。因此, EFD很可能是连接根瘤形成早期和晚期阶段的一个关键调控因子。来自日本百脉根的调控因子LjERF1属于另一个不同的乙烯响应
28、因子群IX (Asamizu et al., 2008), LjERF1在根瘤菌Mesorhizobium loti对宿主的成功侵染过程中发挥着重要作用。接种后, LjERF1只在根的表皮细胞中表达, 在根瘤中没有任何表达, 推测是根瘤形成早期的正调控因子。 Kanamori等(2006)报道了一个核孔蛋白NUP133, 它的基因突变导致了日本百脉根的温敏型结瘤缺失, 即使在适宜的温度下, 也只能形成无效瘤, 侵入线中的少量根瘤菌不能被释放; 而且, 它对钙峰的诱导是必需的; NUP133定位于核膜上。因此, 在宿主植物识别相应的根瘤菌后, NUP133可能在核-质信息交流中起着一定的作用。在
29、对上述突变株的研究中还发现, dmi类和nup133突变株也不能与菌根真菌共生, 真菌不能在植株体内定殖, 表明在这个古老的共生体系中, DMI及NUP类基因在菌根真菌的早期信号传导中同样起着重要作用(Endre et al., 2002; Stracke et al., 2002; An et al., 2004; Mitra et al., 2004; Lvy et al., 2004; Kanamori et al., 2006)。 其他重要的不结瘤突变株还有在根瘤发育或起始信号转换上存在缺陷的日本百脉根突变株nin (Schauser et al., 1999)、来自蒺藜苜蓿的不能发生
30、根毛卷曲的hcl (Wais et al., 2000)等。这两种突变株虽然能够感知结瘤信号并表现根毛变形及显示钙峰, nin (nodule inception)甚至可以发生个别根毛的过度卷曲, 但它们不能形成侵入线、根瘤原基等。NIN含有跨膜结构域和一个DNA结合结构域, 推测是一个转录因子, 从豌豆中分离到它的同源基因SYM35 (Schauser et al., 1999; Borisov et al., 2003)。对蒺藜苜蓿同源突变株Mtnin的研究显示, NF早期信号传递过程并不需要NIN, 但NIN调控着ENOD11的空间表达, 并因此可能控制着结瘤数量; 而且, MtNIN对
31、于自激活CCaMK诱导的自发结瘤过程是必需的。尽管hcl (hair curling)突变株与Mtnin有着相似的表型, 但HCL对于CCaMK诱导的根瘤形成却并非必不可少(Marsh et al., 2007)。研究表明, HCL编码的LYK3受体蛋白与日本百脉根中的NFR1同源, 也含有LysM结构域, LYK3控制着根毛卷曲, 并以依赖于结瘤因子结构的方式控制着侵入线的形成, 可能是结瘤因子的进入受体(Limpens et al., 2003; Smit et al., 2007)。 综上所述, 可以将目前已知的豆科植物早期共生结瘤过程中的信号流及生理反应表示为图2。 3 侵入线的形成及
32、固氮的分子基础 这方面的研究主要通过Fix突变株揭示, 该类突变株虽可结瘤或形成瘤状物, 但不能固氮。从蒺藜苜蓿中分离到了不少这种类型的突变株, 如形成小的、肿块状的无效根瘤的lin、nip、Mtsym1。lin (lumpy infections)只能形成根瘤原基, 侵染过程仅限于根表皮细胞, 皮层细胞中没有侵入线的形成, 接种后的根中检测不到乙炔还原活性(Kuppusamy et al., 2004)。nip (numerous infections and polyphe-nolics)虽然有侵入线的形成, 但发育很不正常, 且 图2 共生结瘤早期结瘤因子的信号传导途径。 Fig. 2
33、The Nod factor signaling pathways during early sym- biotic nodulation. 丑敏霞等: 豆科植物共生结瘤的分子基础和调控研究进展 881doi: 10.3773/j.issn.1005-264x.2010.07.013 极少释放根瘤菌至宿主细胞或根瘤菌不能完成分化, 一些与植物防御有关的基因表达增强(Veere- shlingam et al., 2004)。在Mtsym1 (Bnaben et al., 1995)中, 晚期结瘤素基因如LB1、CAM1、N31不能表达, 也没有乙炔还原活性。最近, Teillet等(2008)
34、从蒺藜苜蓿中分离到一个api (altered nodule pri-mordium invasion)突变株, 表现为根瘤菌的侵染过程刚好在进入根瘤原基之前失败, 结果在与根瘤原基相邻的外皮层中形成大的侵入袋(侵入线变形增大后形成的袋状结构), 在根上形成一些小的瘤状物。研究显示, API与乙烯代谢及结瘤因子信号传递没有关系; 遗传图谱及上位分析显示, API应在ERN1和LIN的下游及NIP的上游行使功能。 从蒺藜苜蓿中, Starker等(2006)还筛选到了8个dnf (defective in nitrogen fixation)突变株, 它们均结白色小瘤。其中, 除了dnf3、dn
35、f6可显示少量乙炔还原活性外, 其余突变株均检测不到固氮酶活性; 包括LB1、CAM1、N31在内的晚期结瘤素基因在大多数dnf突变株中都能正常表达, 只有dnf1、dnf5、dnf2例外: dnf1、dnf5不表达所有上述基因, dnf2则不表达N31。这些突变株中根瘤菌基因nodF (与侵染起始及根瘤发育有关)、exoY (与侵染有关)、bacA (为根瘤菌在宿主细胞中的存活所需)和nifH (固氮基因)的表达结果显示, dnf2中只有少量根瘤支持表达nodF和bacA; dnf1、dnf2和dnf5不能启动nifH的表达, 其余突变株表达nifH的根瘤数量只有野生型的26% (dnf4)
36、、32% (dnf7)或一半(dnf3、dnf6); exoY在dnf3、dnf5、dnf6中的表达显著下降。可见, 一个有功能的根瘤不仅已经完成了组织分化, 还需要为根瘤菌提供合适的环境, 激活相关基因的表达, 才能发挥其固氮功能。 另外, 来自日本百脉根的crinkle (Ljsym79)突变导致侵入线不能穿过表皮细胞, 少数根瘤含有形状不规则的能固氮的类菌体, 能够表达豆血红蛋白基因; 植物本身也出现了异常发育(Tansengco et al., 2003)。在alb1 (Ljsym74)突变株形成的无效瘤中, 根瘤中的维管束发育不全, 根瘤菌被包裹在异常增大了的侵入线中, 不能释放进入
37、植物细胞(Imaizumi- Anraku et al., 2000)。 4 豆科植物结瘤的自主调控分子机制 根瘤的形成虽然有利于植物在氮素营养不足的环境中生存, 但这毕竟是一个耗能的过程, 根瘤数目过多将对植物的生长造成不利的影响, 为了解决这一矛盾, 豆科植物在长期进化中已经发展出一套负反馈调节机制: 已经形成的根瘤能够抑制新的根瘤的形成。豆科植物的这一自主调控机制(autoregulation of nodulation, AON)主要通过根-茎-根之间的长距离信号交流实现: 受结瘤因子刺激后, 根部产生某种信号分子被运至茎部, 茎解读此信号后合成出新的信号分子再输送到根部, 从而对根瘤
38、的数目进行控制。除此之外, 我们认为, AON调控体系还应该包括细胞-细胞间的短距离信号交流。另外, AON调控体系不仅控制着根瘤的数目, 同时也可能控制着根瘤的类型。 4.1 长距离交流体系中根产生的信号分子 日本百脉根超结瘤突变株har1与野生型植株之间的嫁接试验表明, 超结瘤表型由茎的基因型决定, 从而引出茎产生的某种物质对根瘤数量进行控制的推测。序列分析显示, HAR1 (hypernodulation aberrant root formation 1)编码一个富含亮氨酸的类受体激酶, 和来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的CLAVATA1 (CLV1)有着很高的
39、同源性(Krusell et al., 2002; Nishimura et al., 2002a)。CLV1是一个类受体激酶, 在拟南芥中, 通过与经由CLV3加工而来的小分子多肽相结合, 以细胞-细胞的短距离信号传递方式, 调控着茎和花顶端分生组织细胞的增殖(Ogawa et al., 2008)。CLV3属于CLE家族(CLAVATA3/ESR-related family)成员, 研究表明, CLE家族所编码的蛋白或加工后的小分子多肽常常作为胞外多肽激素发挥作用。此外, 大豆、豌豆和蒺藜苜蓿的同源基因产物NARK (nodule autoreg- ulation receptor ki
40、nase; Searle et al., 2003)、SYM29 (Krusell et al., 2002)、SUNN (super numeric nodules; Schnabel, et al., 2005)对根瘤数量的控制也都是通过茎-根之间的长距离信息交流实现的, 这些AON基因均与CLV1有着极高的序列相似性。因此, 有理由认为, AON信号调控系统也可能以CLE蛋白作为多肽激素, 激活了HAR1类受体激酶。 近年, 从日本百脉根中分离到2个CLE基因: LjCLE-RS1和LjCLE-RS2, 研究表明, 这两个基因都只在根中表达, 并在接种根瘤菌后的24 h内表达量迅速上升;
41、 发根转化实验结果显示, 它们在野生型植株根中的过度表达强烈抑制了根瘤的形成, 而882 植物生态学报Chinese Journal of Plant Ecology 2010, 34 (7): 876888 www.plant- 且, 这种抑制效果还能传递至未转化的根; 同时, HAR1这一类受体激酶对于LjCLE-RS1/RS2发挥抑制作用必不可少(Okamoto et al., 2009)。此外, 在蒺藜苜蓿中也发现了两个与根瘤数目控制有关的基因: RALFL1 (rapid alkalinization factor-like 1)和DVL1 (devil 1), 与LjCLE-RS1
42、/RS2类似, 二者的超表达同样引起根瘤数目的急剧下降(Combier et al., 2008a)。但是, 这两个基因是否也作为AON基因行使功能, 尚待进一步研究。已经证实, 乙烯能够以局部调控的方式控制根瘤数目, 这种抑制作用不同于AON的系统控制。蒺藜苜蓿的乙烯不敏感突变体sickle, 也表现过度结瘤现象, 且具备完整的AON调控系统; 其中的相关基因MtSkl1与拟南芥中的乙烯信号传导基因Ein2同源(Penmetsa et al., 2008)。因此, 也可能与MtSkl1类似, MtRALFL1和MtDVL1介导了结瘤因子与乙烯调控系统之间的某种分子 对话。 4.2 长距离交流
43、体系中茎对来自根的信号分子的响应 已有研究表明, LjHAR1的启动子主要在叶、茎, 以及根瘤组织中的韧皮部表达(Combier et al., 2008a)。而韧皮部被普遍认为是长距离信号传递通道(Lough Wasson et al., 2006)。但是, 在大豆中, 类黄酮合成酶基因的沉默导致的结瘤下降可以通过加入结瘤因子等方法解除(Subramanian et al., 2006), 说明至少在大豆中, 类黄酮对结瘤过程的影响也许并不是通过对生长素运输的调控实现的。 虽然来自茎的因子尚未证实, 但其在根中的可能受体或信号中间载体已经被报道: 嫁接试验表明, 与har1不同, 日本百脉根
44、突变株tml (too much love)超结瘤表型是由根的基因型控制的, 而且har1突变不能使tml的根瘤数目明显增加; 此外, TML对结瘤的抑制作用不能在根与根之间传递。因此, TML可能是茎信号分子的根部受体, 在har1下游起作用(Magori et al., 2009)。考虑到AON的系统调控方式, 显然, 在TML下游应该有可移动信号分子的产生, 以使茎对根瘤形成的抑制效应能在根与根之间传递。 除了CLV1类受体激酶, KLAVIER(KLV)是另一个自日本百脉根的茎中获得的AON信号体系成员。但是, klavier突变株除了根瘤数目增多外, 还出现叶脉凸起、开花延迟、植株矮
45、化等现象(Oka-Kira et al., 2005)。日本百脉根的另一突变株astray, 能形成二倍于野生型的根瘤, 且提早结瘤, 在非共生条件下, 此突变株对重力和光的反应存在缺陷(Nishimura et al., 2002b)。ASTRAY能够在植物的叶片、子叶、茎、胚轴、根及根瘤等组织中表达, 根部是否接种根瘤菌对其表达没有明显影响。ASTRAY编码蛋白质LjBzf, 其C端具有亮氨酸锌指结构域, 与拟南芥HY5蛋白高度同源, HY5是一个与光形态发生有关的调控因子; LjBzf的N端含有一个RING- finger和一个酸性区域。Nishimura等(2002b)认为, LjBz
46、f中包含的结构域组合为豆科植物所特有的, 负控制着根瘤的形成。这些现象说明, KLV和ASTRAY可能是植物生长发育过程中一个多功能的普遍性调控因子, 不仅控制着根瘤的形成, 同时还调控着植物的其他生理过程。 4.3 细胞与细胞之间短距离交流对根瘤形成过程的控制 实际上, 除了茎与根之间长距离信号传递体系外, 根瘤起始和根瘤数目的调控应该还包括细胞与细胞之间的短距离分子对话, 后者可能主要以胞间连丝作为交流通道(plasmodesmata, PD)。通过荧光跟踪、绿色荧光蛋白(GFP)报告系统等方法, 研究人员分析了蒺藜苜蓿中PD介导的韧皮部与根瘤原基之间的信息交流情况(Imlau et al
47、., 1999; Complain-ville et al., 2003)。研究发现, 接种根瘤菌后, 在刚刚开始分裂的皮层细胞中, 即可检测到GFP信号, 而根瘤原基正是由这些皮层细胞分裂形成的。在这些根瘤起始细胞中, GFP在细胞分裂完成前即已表达, 丑敏霞等: 豆科植物共生结瘤的分子基础和调控研究进展 883doi: 10.3773/j.issn.1005-264x.2010.07.013 这与PD网络重新排布相一致, 说明PD介导了NF激活后的植物细胞与其他部分之间的分子交流, 这对根瘤的形成可能非常重要(Complainville et al., 2003)。AON体系中最终能在根与
48、根之间进行某种抑制因子的传递, 可能正是经由PD的短距离交流实现的。 4.4 茎对根瘤类型的控制 茎不但控制着结瘤数量, 而且在决定根瘤的类型上也起着重要作用。通常情况下, 蒺藜苜蓿与Sinorhizobium meliloti共生形成不定型根瘤, 而日本百脉根与Mesorhizobium loti共生形成定型根瘤。两者之间的嫁接试验表明, 嫁接了蒺藜苜蓿茎的日本百脉根的根能与M. loti共生形成定型根瘤, 它的超结瘤突变株har1-1的根嫁接到蒺藜苜蓿茎上后可恢复野生型结瘤现象; 然而, 当蒺藜苜蓿的根与日本百脉根的茎嫁接后, 无论接种S. meliloti还是M. loti, 都不能结瘤
49、, 说明日本百脉根的茎不能支持蒺藜苜蓿的根与相应根瘤菌之间的结瘤, 不定型根瘤的形成也许还需要某种来自茎的因子的参与(Lohar Barbulova et al., 2007), 而低浓度的氮能促进植物生长并促进结瘤(Fei Nishimura et al., 2002a; Searle et al., 2003; Schnabel et al., 2005)。在日本百脉根中, 结合态氮的存在抑制了NF诱导的皮层细胞的分裂; 相对于生长在无氮条件下的植株, 在高浓度硝酸盐或铵盐环境中生长的野生型日本百脉根, 在受NF诱导或接种M. loti 24 h后仍无NIN基因的表达; 对于har1-3超结瘤突变株, 即使在培养基中添加10或20 mmolL1KNO3的情况下, NIN仍能被高水平诱导, 但是, 当加入10 mmolL1 NH4NO3或琥珀酸铵时, NIN的表达与野生型一样被抑制。说明硝态氮和铵态氮可能在根瘤原基形成的不同时期发挥抑制作用, 而NI