1、微 生 态 活 菌 制品总 论 中国药典 2015年版 微 生 态 活 菌 制品总 论 微生 态 活菌制品系 由 人体 内正常 菌群 成 员 或具 有 促 进 正常 菌群生长和活性 作 用的 无 害 外 籍 细菌，经 培 养 、收 集 菌 体 、干 燥成 菌 粉 后 ，加 人 适 宜 辅料 混 合制 成。 用 于 预 防 和 治疗 因菌群 失 调引 起 的相 关 症 状 和 疾 病。 微生 态 活菌制品 必须 由非致病 的活细菌组 成 ，无 论在 生 产 过程 、制 品 贮 存 和 使 用 期 间 均 应 保 持 稳 定 的 活 菌 状 态 。它 可由一 株 、多 株 或 几 种细菌制 成 单
2、价 或 多价联合制 剂 。根 据 其 不 同 的 使 用 途 径 和 方 法 可 制 备 成 片 剂 、胶囊 颗 粒 剂 或 散 剂等多种剂型 。 基本要求 微生 态 活菌制品的制 备 方 法 、工艺 应 能保 证 成 品 含 有 足够 的活菌数量， 保 持 其稳 定性， 同时 应 防止外源 因子的 污染 。 生 产 和 检 定用设 施、原材料 及 辅料、 水 、器 具 、 动 物 等 应 符 合 “ 凡例 ”的有 关要求 a 制 造 生 产 用菌神 生 产 用 菌 种 应 符 合 “ 生物制品生 产检 定用菌毒种 管理 规 程 ”的有 关 规定 。 1. 名 称 及 来 源 选 用的生 产
3、用菌种 应来 自 人体 内正常 菌群， 或对 人体 无 毒 无 害 、具 有 促 进 正 常 菌 群 生 长 和 活 性 作 用 的 外 籍 细 菌 。细菌的分 离 过程 和 传代 背景 应清 晰 ，应 具 备 稳 定的生 物 学 和 遗 传 学特 性， 并能保 持 稳 定的活菌 状 态 ，经 实验 室 和 临床 试验 证明安 全 、有 效 。 2. 种子 批 的 建立 生 产 用 菌 种 应 按 照 “ 生物制品生 产检 定用菌毒种 管理 规 程 ”的有 关 规定 建立 种子 批 系 统。 三 级 种子 批 应 分 别 冻 干 ， 置 适 宜 温 度 保 存 ; 种子 批 传代应 限定 传代
4、 次数， 原 始 种 子 批 和 主 种 子 批 启 开 后 传 代 次 数 不 得 超 过 10 代 ，工作 种子 批 启 开 后 至 发酵 培养传代 次数不 得超过 5 代 。 3. 种子 批 的 检 定 菌种的 属 、种型分 类 鉴 定， 应 依 据 最 新版 伯 杰 氏 细菌 系 统 鉴 定 手 册 （ Bergey s Manual of Systematic Bacteriolo gy) 和 伯 杰 氏 细 菌 命 名 手 册 （ Bergey s Manual of Determi native Bacteriology)的有 关 规定 进 行， 包括 形 态 、生长 代 谢 特
5、 性 检查。原 始 种子 或 主 种子 还应做 遗 传 特 性和抗生素 敏 感 性等 检查。 三 级 种子 批常 规 检查包括以下 3 项 ： (1) 培 养 特 性 及 染 色 镜 检 将 菌 种 接 种 于 适 宜 培 养 基 ，置 有 氧或 厌 氧 环境 中 培养 ，观 察 其 生长 情况 ，确 定菌 种 为 需 氧 性细菌 或 厌 氧 性细菌 ；以 划 线 法 观 察 在 琼脂 平 皿 上 生长 的 单 个 菌 落 的 形 状 、大 小 、表 面 、边 缘 、透 明 度 、 色 泽 等 特 征 ；也 可 观 察 菌 种 在 不 同 温 度 、p H 值 或 不 同 浓 * 44 度的
6、氣 化钠 溶液等 条件下 的生长 特 性等 。 取 菌种的新 鲜 培养 物 涂 片 做 革 兰 氏染 色，在 显 微 镜 下 观 察 菌体的 染 色 反 应 、形 态 、大 小和 排 列 等，有 芽孢 的细 菌 应 同时 观 察芽孢 的 形 状 、大 小 和 位 置 （ 也 可 增 做芽孢染 色） 。检查 结 果 均 应 符 合 原 始 菌种的 特 性 。 (2) 生 化 反 应 按 通 则 3605 “ 细菌生 化反 应培养 基 ” 选择 相 应 的 培养 基或其他 适 宜 的 方 法 进 行，结 果应 符 合 原 始 菌种的 特 性 。 (3) 毒 性 试 验 毒 性 试 验 是 通 过
7、动 物 试 验 检 查 菌 种 是 否 存在不 安 全因素， 以保 证 人体 使 用 安 全 。 用 体 重 1822g小 鼠 5 只 ，每 只 腹 腔 注 射 0.3ml新 鲜 菌 液 (不 少 于 1. OX 109CFU/0. 3ml)，连 续 观 察 3 天 ，小 鼠 均 应健康 存活 、体重增 加；或 每 只 小 鼠 经 口 灌 胄 0.5mi 新 鲜 菌 液 (不 少 于 L0X103CFU/0. 5ml), 每 天 1 次 ， 连 续 3 天 ，从 第 1 天 灌 胃 起连 续 观 察至 第 7 天 ，小鼠 均 应健 康 存活 、体重增 加。 除 另 有 规 定 外 ，原 始 种
8、 子 或 主 种 子 批 还 需 进 行 以 下 检 查 ： (1) 细菌 代 谢 产 物 脂 肪 酸 测 定 照 气 相 色 谱 法 (通 则 0521) 或 其 他 适 宜 的 方 法 进 行 ， 应 符 合 该 菌 种 的 特 性 。 (2) 遗 传 特 性 分 析 可 采 用 16S rRNA 序列 测定 或其 他 适 宜 方 法 进 行， 应 符 合 诙 菌种的 遗 传 特 性 。 (3) 抗 生 素 敏 感 性 试 验 采 用 琼 腊 扩 歡 纸 片 法 或 其 他 适 宜 方 法 逬 行菌 株 的抗生素 敏 感 性 检查 ，应 符 合 诙 菌种的 特 性 。 (4) 稳 定 性
9、试 验 菌 种 在 适 宜 培 养 基 中 ， 连 续 传代 30代 次 后 ，将 第 30 代培养 物 做 种子 批检 定，全部 检査 结 果应 与 原 始 菌种的 特 性 一致。 4.种子批的保存 原 始 种子和 主 种子 应 冻干 保 存 于 8C以下 ，工作 种子 应 置 于 适 宜 温 度 保 存 。 菌 粉 制 造 应 包括 种子液制 备 、大 罐 培 养 、收 获 菌 体 （ 或 芽 孢 ） 和菌体干 燥 制 成 菌 粉 。如生 产 多价制品 时 ，应每 种菌分 别 培 养 ，制 备 单价菌 粉 。 1. 生产用种子 启 开 工 作 种 子 批 菌 种 ， 接 种 于 适 宜 培
10、 养 基 进 行 多 级 种 子 扩 增 ， 应 涂 片 做 革 兰 氏 染 色 ，在 显 微 镜 下 观 察 510个 视 野 ，细 菌 的 染 色 反 应 、形 态 应 一 致 并 符 合 原 始 菌 种 的 特 征 。制 备 过 程 应 防 止 污 染 ，菌 种 传 代 次 数 应 符 合 规 定 。 2. 生产用培养基 采 用经 批准 的 培养 基 用 于 生 产。 3.培养 采 用液体 培养 。将 种 子 液 置 适 宜 条 件 下 培 养 （ 包括 厌 氧或 需 氧、 温 度 、时间 等 ） ， 培养过程 中 取样 涂 片 做 革 兰 氏染 色 镜 检、 p H 值 检 测 等 ，
11、 芽孢 菌 需 进 行 芽孢 形 成 率 的中国药典 2015年版 微 生 态 活 菌 制品总 论 检 测 ， 均 应 符 合规定 。培养 结 束 后 取样做纯 菌 检查 ，如发 现 污染应 予废弃 。 生 产 多价制品的单价菌 粉 时 ，应 分 别 培养 。 4. 收 获 菌体和制 成 茴 粉 培养 结 束 后离 心 收 获湿 菌体，与 适 宜 的分 散 剂 、稳 定 剂 混 合 。采 用 真 空冷 冻干 燥 法干 燥 菌体， 芽孢 菌 可采 用 加 热 千 燥方 法， 再 经 粉 碎、 过筛 制 成 粉 末 状 菌 粉 。 5. 菌 粉 的 保 存及有效 期 应 通 过 活菌 稳 定性 试
12、验确 定 保 存 温 度和有效 期。 6. 菌 粉 检 定 按 “ 菌 粉 检 定 ”项 进 行 ， 符 合规定 后方可进 行 半成 品 配 制 。 半成 品 1. 配 制 同一工作 种子 批 菌种生 产 的 最 多 2 批 单价菌 粉 可按批 准 的 比 例 与 辅 料 混 合 均 匀 后 制 成 半 成 品 。配 制多价制品 时 ，应将 各单价菌 粉 、辅料按 配 方 比 例 和 配 制 程 序 混 合 均 匀 ，配 制 过程应 防止 污染 。 2. 半成 品 检 定 按 “ 半成 品 检 定 ”项 进 行 ， 应 符 合规定 。 成 晶 1. 剂型制 备 根 据制品的用 逾 、使 用 对
13、 象 和用药 逾 径 等因素 确 定剂 麵 。制 备 过 程 应 符 合 通 则 “ 制 剂 通 则 ” 项 下 相 关 剂 型 的 规 定 。 2. 分批 成 品 批 号 应 在 半成 品 配 制 后确 定， 配 制 日 期即为 生 产 曰 期。同一批 号的制品， 应来 源一致、 质 量 均 一 ，按 规定 要求 抽 样 检验后 ，能对 整 批 制品 作 出 评 定 。应 根 据 验 证 结 果 ，规定 半成 品的分装 时间 ，如 超 过 24 小 时 ，应 分 为 不 同 的亚 批。 3. 分装 、规格和 包 装 制 品 的 分 装 应 符 合 通 则 “ 制剂通则 ”的有 关 规定 。包
14、 装 应 符 合 “ 生物制品 包 装规 程 ”的有 关 规定 。规格 应 符 合 批准 的规格 要求。 裣 定 微生 态 活菌制品质量 检 定 应 包括 菌 粉 检 定 、半成 品 检 定和 成 品 检 定 。 菌 粉 检 定 1. 外 观 应 为白 色 、灰 A 色 或 灰 黄 色 粉 末 。 2. 目的菌 检査 取少 量菌 粉 加 人 适 量 灭 菌生 理氯化钠 *液 或其他 适 宜 稀释 液 后 ，涂 布 在 适 宜 琼 脂 平 皿 上 ，在 适 宜 条 件 下 培 养 ， 其 培养 物的生长 特 性和 染 色 镜 检 的 特 征 应 符 合生 产 用 繭 种 特 征 . 。 3. 杂
15、 菌 检查 方 法 和 结 果 判 断 见 本 总 论 附 录 3。如 不 符 合 规 定 应 废 弃 。 4.干 燥 失 重 菌 粉 中 残 余 水分的 含 量会 直接影响 活菌的生存， 须 进 行菌 粉 干 燥失 重的 检查。 应 按 通 则 0831或 仪器 方 法测定 。 5.活 蔺 数 测定 测 定 每 克 菌 粉 中 含 有 的 活 菌 数 量 。方 法 见 本 总 论 附 录 2 。 半 成品检定 半成 品 须做 杂 菌 检查 ，根 据用药 途 径 确 定 杂 菌 检查 的 质 控指标。方 法和结 果判断 见 本总论 附录 3。 成 品检定 1. 鉴 别试验 检 査 成 品 中
16、所 含 的 目 的 菌 是 否 符 合 生 产 用 菌 种 的 特 性 。即 按 上 述 “ 种子 批 的 检 定 ”方 法 进 行生长 特 性 、染 色 镜 检 和生 化反 应 检查 ，应 符 合规定 。对于 多价制品，则 须 逐 一检查 单价菌 特 性 。 2.理化检 查 (1) 外 观 根 据 剂 型 ， 观 察 制品的 外 观 、色 泽 。 片 剂 外 观 应完 整 、光 洁 ，呈 白 色 或类白 色， 间 有菌 粉 色 斑 ；顆 粒 剂 、散 剂和胶囊剂 内 粉 末 的 粒 子 大 小 、色 泽 应 均 匀 ，间 有菌 粉 色 斑 (2) 干 燥 失 重 按 通 则 0831或 仪
17、器 方 法 测 定 ， 除另 有规定 外 ，减 失 重 量 应 不 得 超 过 5.0% ，芽 孢 菌制品 应 不 得超过 (3) 粒 度 散 剂 和 颗 粒 剂 应 进 行 粒 度 检 查 。 按 通 则 0982第 二 法 ， 采 用单 筛 分法 或 双 筛 分法 检查 ， 应 符 合规定 。 (4) 装 量 （ 重量） 差 异 各 剂 型 按 通 则 “ 制 剂 通 则 ” 的相 应 规定 进 行， 应 符 合规定 。 (5) 崩 解 时 限 胶 囊 剂 、片 剂 按 通 则 0921迸 行 ， 应 符 合规定 。 3.活 菌 数 测定 按 本 总 论 附 录 2 方 法测定 每克 制品
18、中的活菌数， 应 符 合 规定 。多价制品 应 分 别 测定各单价活菌数 。 4.杂菌 检 査 目的 是检查成 品中 外源 微生物的 污染 情况 ，以保 证 人 体 使 用 安 全 。 方 法 和 结 果 判 断 与 半 成 品 的 “ 杂 菌 检查 ”项 相 同。 5.安 全 试验 安 全 试验是 通 过 动 物 试验进 行 的 非 特异 性毒性 检 查 ， 应 根 据制品的 使 用 途 径 和人用剂量 确 定 试验方 法 。 (1) 肠 道 微 生 态 活 菌 制 品 检 查 称 取 2g 制 品 ， 加 人 8ml 生 理氯化钠 溶液中， 混 合 均 匀 。用 S 只 体 重 1822g
19、 小 鼠 ， 每 只 小 鼠 经 口 灌 冑 0*5ml，每 天 1 次 ， 连 续 3 天 。 自 第 1 天 灌 胃 起 ，连 续 观 察 ？ 天 ，小鼠 应 徤 康 存活 、体重 增 加 ，判 为 合 袼 。如不合 格 ， 可 另 选 10 只 小 鼠 复 试 1 次 ， 判 定 标准同 前 。 (2) 阴 道 徼 生 态 活 菌 制 品 检 查 用 2426g雌 性 小 鼠 5 45 *微 生 态 活 菌 制品总 论 中国药典 2015年版 只 ，每 只 小鼠 阴道 内 置 入 10mg制品， 每 天 1 次 ， 连 续 3 天 1 自 给 药第 1 天 起 ，连 续 观 察 7 天
20、，小鼠 应健康 存活 、体重增 加 ，阴道局 部 无 红肿 、分 泌 物等 症 状 ，判 为 合格 。 保 存 、运 输 及 有效 期 按批准 的 温 度 保 存和 运输。 自 生 产之 日 起 ，按批准 的 有效 期执 行 。 附录 附 录 1 已 批准上 市的微生 态 活菌制品 附 录 2 微生 态 活菌制品活菌数测定法 - 附 录 3 微生 态 活菌制品 杂 菌 检查 法 使用 说 明 应 符 合 “ 生物制品 包 装规 程 ”规定和 批准 的 内容。 附录 1 已 批准 上 市 的 微 生 态 活 菌 制品 制品名称 细菌 种 类 双 歧 杆 菌 活 菌 胶囊 青 # 型 *歧 杆 菌
21、 双 歧 杆 菌 活 菌 散 青春 型 双 歧 杆 菌 长 型 双 歧 杆 菌 双 歧 杆 菌 . H 联 活 菌 胶囊 嗜 酸 乳杆 菌 粪 肠球 菌 长 型 双 歧 杆 菌 双 歧 杆 菌 三 联 活 菌 肠 溶 胶囊 嗜 酸 乳杆 菌 粪 舾 球 菌 长 型 双 歧 杆 菌 双 歧 杆 菌 三 联 活 菌 散 嗜 酸 乳杆 菌 粪 肠球 菌 长 型 双 歧 杆 菌 双 歧 杆 菌 乳杆 菌 三 联 活 菌 片 保加 利 亚 乳杆 菌 嗜热链 球 菌 地 衣芽孢 杆 菌 活 菌 胶囊 地 衣芽孢 杆 菌 地 衣芽孢 杆 菌 活 菌 颗 粒 地 衣芽孢 杆 菌 地 衣芽孢 杆 菌 活 菌 片
22、 地 衣芽孢 杆 菌 蜡 样 芽孢 杆 菌 活 菌 胶囊 蜡 样 芽孢 杆 菌 蜡 样 芽孢 杆 菌 活 菌 片 蜡 样 芽孢 杆 菌 婴儿 型 双 歧 杆 菌 嗜 酸 乳杆 菌 双 歧 杆 菌 四 联 活 菌 片 粪 肠球 菌 蜡 样 芽孢 杆 菌 酪 酸 梭 菌 活 菌 胶囊 酪 酸 梭 状 芽孢 杆 菌 酪 酸 梭 菌 活 菌 散 酪 酸 梭 状 芽孢 杆 菌 酪 酸 梭 菌 活 菌 片 酪 酸 梭 状 芽孢 杆 菌 续表 制品名称 细菌 种 类 凝 结 芽孢 杆 菌 活 菌 片 凝 结 芽孢 杆 菌 酪 酸 梭 状 芽孢 杆 菌 酪 酸 梭 菌 二 联 活 菌 胶囊 婴儿 型 双 歧
23、杆 菌 酪 酸 梭 状 芽孢 杆 菌 酪 酸 梭 菌 二 联 活 菌 散 婴儿 型 双 歧 杆 菌 祜 草 杆 菌 活 菌 胶囊 祜 草 芽孢 杆 菌 枯 草 芽孢 杆 菌 祜 草 杆 菌 肠球 菌 二 联 活 菌多 维 颗 粒 屎 肠球 菌 枯 草 芽孢 杆 菌 枯 草 杆 菌 肠球 菌 二 联 活 菌 胶囊 屎 肠球 菌 阴 道 用 乳杆 菌 活 菌 胶囊 德氏 乳杆 菌 附录 2 微 生 态 活 菌 制品 活 菌 数 测定法 无 菌 称 取 3. Og 制 品 或 菌 粉 （ 胶 囊 取 内 容 物 ） ， 加 人 27. 0ml稀 释 液 中 ， 充 分 摇匀 ，做 10 倍 系 列
24、稀 释 （ 最 终 稀 释 度 根 据 不 同 的 指 标 要 求 而 定 ） 。取 最 终 稀 释 度 的 菌 液 1001,滴 人 选 择 性 琼 脂 培 养 基 平 皿 上 ，共 做 3 个 平 皿 ， 并以 玻 棒涂 布均 匀 ，置 适 宜 条件下 墙 养 ，到期 观 察每个 平 皿 菌 落 生长 情况 ，并 计 数 。当 平 皿 菌 落 数 小 于 10 或大于 300时 ，应 调 整 最 终 稀释 度，重 新 测 定 。根 据 3 个 平 皿 菌 落 总数 按下列 公式计 算 活菌数： 活 菌 数 (CFU/g)- xiOX最 终 稀释 度 【 附 注 】 （ 1 ) 活 菌 数
25、用 “ CFU”表 示 ，即为 细菌 集 落 单位 。 (2) 稀释 液 使 用 灭 菌生 理氯化钠 溶液 或其他 适 宜 的 稀 释 液 。 (3) 选择 性 琼脂 培养 基 ，是 指 最 适 宜 制 剂 （ 或 菌 粉 ） 中活菌生长的 培养 基。 须 经 批准后方可使 用 。 附录 3 微 生 态 活 菌 制品 杂菌 检 查 法 微生 态 活菌制品 杂 菌 检查 法系 检查 微生 态 活菌制品的菌 粉 、半成 品及 成 品 受 外源 微生物 污染程 度的 方 法 。检查项 目 包括控 制菌 检查 ，非致病 性 杂 菌 、真 菌计数 。 杂 菌 检查 应 在 环境 洁 净 度 10 000
26、级 下 的 局 部 洁 净 度 100 级 的单 向流 空 气 区 域 内进 行 。检验 全 过程必须严 格 遵守 无 菌 操 作 ，防 it再 污染 Q 单 向流 空 气 区 域 、工作 台 面 及 环境 应 定 期 按 医 药 工 业洁 净 室 （ 区 ）悬 浮 粒 子 、浮 游 菌和 沉 降 菌的 测 试方 法 的 现 行国家 标准进 行 洁 净 度 验 证 。 除 另 有 规 定 外 ，本 检 査 法 中 细 菌 培 养 温 度 为 30 37C;真 菌 培 养温 度 为 2028C。 * 46 中国药典 2015年版 检验 量及 供 试 品的 准 备 检 验 量， 即 一 次 试 验
27、 所 用 的 供 试 品 量 （ g)。检 验 时 ， 应 从 t 个 以上最 小 包 装单位中 随 机 抽 取 不 少 于 3 倍 检验 用 量的 供 试 品 。 菌 粉 、_成 品 以 及 成 品 为 散 剂和 颗 粒 剂的 可 直接 称 取 备 用 ；成 品 为片 剂 、胶囊剂的 需 研 碎后 备 用 。 控 制菌 检査 控 制菌 检查 用 培养 基 的 适 用性 检査 控 制 菌 检 查 用 的 培 养 基 ，即 成 品 培 养 基 、 由 脱 水 培 养 基 或 按 培 养 基 处 方 配 制 的 培 养 基 ，均 应 进 行 培 养 基 的 适 用 性 检 查 。检 查 项 目 包
28、 括 促 生 长 、指 示 和 抑 制 特 性 能 力 。 菌 种 试 验 所 用 的 菌 株 传 代 次 数 不 得 超 过 5 代 （ 从 菌 种 保 藏 中 心获 得 的 冷 冻干 燥 菌种 为 第 0 代 ） ，并采 用 适 宜 的菌种 保藏 技 术 ，以保 钲 试验 菌 株 的生物 学特 性 。 大 肠 埃 希 菌 (Escherichia coli) CMCC (B) 44102 金 黄 色 葡 萄 球 菌 (Staphylococcus aureus ) CMCC (B) 26003 乙 型 副 伤 寒 沙 门 菌 (Salmonella p a m typ h i扮 CM CC
29、 (B) 50094 锏 绿 假 单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) CMCC (B) 10104 生 孢梭 菌 (Clostridium sporogenes ) CMCC (B) 64941 白 色 念 珠 菌 (Candida albicans) CMCC (F) 98001 _ 疾 志 贺 菌 (Shigella dysente.riae) CMCC (B) 51252 菌 液 制 备 接 种 大 肠 埃 希 菌 、金 黄 色 葡萄 球菌 、乙型 副 伤 寒沙 门 菌 、铜 绿 假 单胞菌的新 鲜 培养 物 至 营 养肉 汤 培 养 基或 营 养 琼脂 培养 基
30、中， 接 种生 孢梭 菌的新 鲜 培养 物 至 硫 乙 醇 酿盐流 体 培养 基 中， 培 养 1824 小 时 ； 接 种 白 色 念 珠菌的新 鲜 培养 物 至改良马 丁 培养 基或 改良马 丁 琼脂 培 养 基 中 ， 墙 养 2448 小 时 。 用 0.9% 无 菌 氯化钠 溶液制 成 每 1ml 含 菌 数 为 10100CFU 或 1001000CFU的菌 悬 液 。 菌 悬 液 制 备 后 应 在 2 小 时 内 使 用 ， 若 保 存 在 28 C 的菌 悬 液 可以 在 24 小 时内使 用 。 适 用 性 检査 控 制菌 检查 用 培养 基 的 适 用性 检查 所 用 的
31、菌 株 及 检 测 项 目 见 表 1。 表 1 控 制菌 检查 用 培养 基 的 促 生长 、抑 制和 指示能力检査 控 制菌 培养 基 特 性 试验 菌 株 胆 盐乳 糖 促 生长 能力 大 肠 埃 希 菌 大 肠 埃 希 菌 培养 基 抑 制 能力 金 黄 色 葡萄 球菌 曙 红 亚 甲 蓝 琼脂 培 养 基 促 生长 能力 + 指示能力 大 肠 埃 希 菌 微 生 态 活 菌 制品总 论 续表 控 制菌 培养 基 特 性 试验 菌 株 沙 门 菌 、志 贺 菌 胆 盐乳 糖 培养 基 促 生长 能力 乙型 副 伤 寒沙 门 菌 、 痢 疾 志 贺 菌 抑 制 能力 金 黄 色 葡萄 球
32、菌 沙 门、 志 贺 菌 属 琼脂 培 养 基 促 生长 能力 + 指示能力 乙型 副 伤 寒沙 门 菌 、 痢 疾 志 贺 菌 铜 绿 假 单胞菌 N A C 液体 培养 基 促 生长 能力 铜 绿 假 单胞菌 抑 制 能力 金 黄 色 葡萄 球菌 N A C 琼脂 培养 基 促 生长 能力 耀 绿 假 单胞菌 抑 制 能力 大 肠 埃 希 菌 绿 脓 菌素测 定 用 培 养 基 促 生长 能力 + 指示能力 铜绿 假 单 胞 菌 金 黄色 葡 萄 球 菌 7.5%氯化 钠 肉 汤 培 养 基 促 生长 能力 金 黄 色 葡萄 球菌 抑 制 能力 大 肠 埃希 菌 甘 露 醇氯 化钠 琼脂
33、培养 基 促 生长 能力 + 指示能力 金 黄 色 葡萄 球菌 抑 制 能力 大 肠 埃希 菌 梭 菌 梭 菌增菌 培养 基 促 生长 能力 生 孢梭 菌 哥伦 比 3E琼 脂 培养 基 促 生长 能力 生 孢梭 菌 白 色 今 株 凿 / 这 、 蹈 沙 氏 葡萄 糖 肉 涵 培 养 基 促 生 长 能 力 甶色 念 珠菌 沙 氏 葡萄 糖 琼脂 培养 基 促 生长 能力 + 指 忝 能力 白 色 念 珠菌 念 珠菌 显 色 培养 基 促 生 校 能力 十 指汞能力 白 色 念 珠菌 抑 制 能力 大 肠 埃 希 菌 1% 聚 山梨 酯 80玉 米 琼脂 培养 基 促 生长 能力 + 指示能
34、力 白 色 念 珠菌 (1) 增 菌 培 养 基 促 生 长 能 力 检 查 分 别 接 种 不 超 过 100CFU 的 试验 菌 于 被 检 培养 基 和 对照 培养 基 中，在相 应 控 制菌 检查 规定的 培养温 度及 最 短 培养 时间下 培养 。与 对 照 培养 基 比较 ，被 检 培养 基试验 菌 应 生长 良好 。 (2) 固 体 培 养 基 促 生 长 能 力 检 查 取 试 验 菌 各 0.1ml (含 菌 数 50100CFU) 分 别 涂 布 于 被 检 培养 基 和 对照 培 养 基 平 皿 中， 每 种 培养 基 平行制 备 2 个 平 皿 ，在相 应 控 制 菌
35、检查 规定的 培养温 度及 最 短 培养 时间下 培养 。被 检 培养 基 与 对 照 培 养 基 相 比 ，生 长 的 菌 落 大 小 、形 态 特 征 应 一 致 。 (3) 培 养 基 抑 制 能 力 检 查 接 种 不 小 于 100CFU 的 试 验 菌 于 被 检 培养 基 中，在相 应 控 制菌 检查 规定的 培养温 度 及 最 长 时间下 培养 ，试验 菌 应 不 得 生长 。 (4) 培 养 基 指 示 能 力 检 查 分 别 接 种 不 超 过 100CFU 的 试验 菌 于 被 检 培养 基 和 对照 培养 基 平 皿 上 ，在相 应 控 制 菌 检查 规定的 培养 溫
36、度及 时间下 培养 。被 检 培养 基 中 试验 47微 生 态 活 菌 制品总 论 中国药典 2015年版 菌生长的菌 落形态 、大 小 、指示 剂 反 应 情况 等 应 与 对照 培 养 基一致。 供 试 品 检査 供 试 品的 控 制菌 检查 应 按下 述 方 法 进 行 。 阳 性 对 照 试 验 供 试 品 进 行 控 制 菌 检 查 时 ，应做 阳 性 对照试验。 取 阳 性 对照 菌 于 相 应选择 性 培养 基 平 皿 上 划 线 接 种 ， 按 供 试 品的 控 制菌 检查方 法 培养 ，观 察 菌 落 生长 情 况 。 阳 性 对照试验 应 检 忠 相 应 的 控 制菌 。
37、 阴 性 对 照 试 验 取 增 菌 液 0.1ml，照 相 应 控 制 、 菌 检查 法 检 査 ，作为 阴 性 对照。 阴 性 对照 应 无 菌生长 。 1. 大 肠 埃 希 菌 (Escherichia coli) (1) 增 菌 培 养 称 取 供 试 品 lg，加 到 9ml 灭 菌 胆 盐 乳糠 墙 养 基 中， 培 养 1824 小 时 。 (2) 特 异 培 养 将 上 述 增 菌 液 摇 匀 ，取 0.1ml滴 加到 曙 红 亚 甲 蓝 琼 脂 平 皿 上 ，以 玻 櫸 涂 匀 ，一 式 3 份 ，培养 1824 小 时 ，观 察 菌 落 生长 情况。 (3) 结 果 判 定
38、 阳 性 对 照 平 皿 应 长 出 紫 黑 色 、圆 形 、 稍凸 起 、边緣螯 齐 、表 面 光 滑 、带 有 金属光 泽 的 菌 落 。 供 试 品平 皿 上 若 未 见 菌 落 生长 或 生长的菌 落 与 阳 性 对 照 的菌 落形态 特 征 不 符 ，判供 试 品未 检 出 大 肠 埃 希 菌 ；若 生长的菌 落 与 阳 性 对照 的菌 落形态 特 征 相 符或 疑 似 ，应做 革 兰 氏染 色 镜 检 等 适 宜 的 鉴 定 试验 ，鉴 别是否为 制品中的 目的菌 或大 肠 埃 希 菌 。 2. 志 贺 菌 (Shigella、沙 门 菌 (Salmonella) (1) 增 菌
39、培 养 称 取 供 试 品 lg，加 到 9ml 灭 菌 胆 盐 乳 糖 培养 基 中， 培 养 1824 小 时 。 (2) 特 异 培 养 将 上 述 增 繭 液 摇 匀 ，取 0. lml滴 加到 沙 门 、 志 贺 菌 属 琼脂 平 皿 上 ，以 玻 棒涂 匀 ，一 式 3 份 ，培 养 2448 小 时 ，观 察 菌 落 生长 情况。 (3) 结 果 判 定 阳 性 沙 门 菌 对 照 平 皿 应 长 出 无 色 透 明 或半 透 明 、圖 形 、光 滑 、稍 隆 起 菌 落 ，中 心 呈 黑 褐 色 。阳 性 志 贺 菌 对照 平 皿 应 长出 无 色 、半 透 明 、圆 形 、微
40、 凸 、光 滑 的菌 落 。 供 试 品 平 皿 培 养 24 小 时 、 48 小 时 各 观 察 结 果 1 次 ， 若 未 见 菌 落 生长， 判供 试 品未 检 出 志 贺 菌 、沙 门 菌 ；若 有 菌 落 生长， 应 与 阳 性 对照 的菌 落 比较 ，并 做 革 兰 氏染 色 镜 检 等 适 宜 的 鉴 定 试验 ，鉴 别是否为 制品中的目的菌 或 志 贺 菌 、沙 门 菌 。 3. 铜 绿 假 单 胞 菌 （ a e r u g i n o s a ) (1) 增 菌 培 养 称 取 供 试 品 lg, 加 到 9ml 的 N A C 液 体 培养 基 中， 培 养 1824
41、小 时 。 (2) 特 异 培 养 将 上 述 增 菌 液 摇 匀 ，取 0.1ml滴 加到 N A C 琼脂 平 皿 上 ，以 玻 棒 涂 匀 ，一 式 3 份 ，培 养 1824 小 时 ，观 察 菌 落 生长 情况。 (3) 结 果 判 定 阳 性 对 照 平 皿 应 长 出 产 绿 色 色 素 的 菌 落 ，可使 整 个培养 基 呈 绿 色 。 如平 皿 上无 菌 落 生长 或 生长的菌 落 与 阳 性 对照 菌 落形 态 特 征 不 符 ，判供 试 品未 检 出 铜 绿 假 单胞菌 ；如平 皿 生长 48 的菌 落 与 上 述 菌 落形态 特 征 相 符或 疑 似 ，应 挑 选 23
42、 个 菌 落 ，分 别 接 种 于 营 养 琼 脂 培 养 基 斜 面 上 ，培 养 1824 小 时 。 取 斜 面 培 养 物 进 行 革 兰 氏 染 色 、镜 检 及 氧 化 酶 试 验 ，鉴 别是否为 制品中的目的菌 或 铜 绿 假 单胞菌 。 氧 化 酶 试验 取洁 净 滤纸 片 置 于 平 皿 内 ，用 无 菌玻 櫸 取 斜 面培养 物 涂 于 滤纸 片上 ，滴 加 新 配 制 的 1% 二 盐 酸二 甲基对苯二 胺 试 液，在 30 秒 内 若培养 物 呈粉 红 色 并 逐 渐 变为 紫 红 色 为氧化 酶 试验 阳 性， 否 则 为 阴 性 。 若 斜 面培养 物 为非 革 兰
43、 氏 阴 性 无 芽孢杆 菌 或氧化 酶 试 验 阴 性， 均 判供 试 品未 检 出 铜 绿 假 单胞菌 。否 则 ， 应 进 行 绿 脓 菌素 试验。 绿 脓 蔺 素（ Pyocyanki) 试 验 取 斜 面 培 养 物 接 种 于 P D P 琼 腊 培养 基 斜 面 上 ，培 养 2 4 小 时 ，加 三 氯 甲 烷 3 Sml 至培养 管 中， 搅 碎 培养 基并 充 分 振 摇 。静 置 片 刻 ，将 三 氯 甲 烷 相 移 至 另 一 试 管 中 ， 加 入 Im o l/L 盐 酸试 液 约 1ml, 振 摇 后 ，静 置 片 刻 ，观 察 。若 盐 酸 溶 液 呈 粉 红
44、色 ， 为 绿 脓 菌素 试验 阳 性， 否 则 为 阴 性 。同时 用未 接 种的 PDP 琼 脂 培 养 基 斜 面 同 法 作 阴 性 对 照 ，阴 性 对 照 试 验 应 呈 阴 性 。 若 上 述 疑 似 菌 为 革 兰 氏 阴 性 杆 菌 、氧化 酶 试验 阳 性及 绿 脓 菌素 试验 阳 性， 判供 试 品 检 出 铜 绿 假 单胞菌 ；若 上 述 疑 似 菌 为 革 兰 氏 阴 性 杆 菌 、氧化 酶 试验 阳 性及 绿 脓 菌素 试 验 阴 性， 应继 续 进 行 适 宜 的 鉴 定 试验 ，确认是否为 铜 绿 假 单胞菌 。 4 .金 黄色 葡萄 球 菌 （ d w m w
45、 ) (1) 增 菌 培 养 称 取 供 试 品 lg，加 到 9m!7.5%灭 菌 氯 化钠 肉 汤 培养 基 中， 培 养 1824小时 。 (2) 特 异 培 养 将 上 述 增 菌 液 摇 匀 ，取 0.1ml滴 加到 甘 露 醇氯化钠 琼脂 平 皿 上 ，以 玻 棒涂 匀 ，一 式 3 份 ，培养 1824 小 时 ，观 察 菌 落 生长 情况。 (3) 结 果 判 定 阳 性 对 照 平 皿 应 长 出 产 金 黄 色 素 的 圖 形 、凸 起 、边缘 整 齐 的菌 落 。 供 试 品平 皿 上 若 未 见 菌 落 生长 或 生长的菌 落 与 阳 性 对 照 菌 落形态 不 符 ，
46、判 未 检 出 金 黄 色 葡萄 球菌 ；若 平 皿 上 生 长 的 菌 落 与 阳 性 对 照 品 的 菌 落 特 征 相 符 或 疑 似 ，应 挑 选 23个 菌 落 ，分 别 接 种 于 营 养 琼 脂 培 养 基 斜 面 上 ，培养 1824 小 时 。 取 营 养 琼 脂 培养 基 的 培养 物 进 行革 兰 氏染 色 ， 并 接 种 于 营 养肉 汤 培养 基 中， 培 养 1S24 小 时 ，做 血浆 凝 固 酶 试验。 血 浆 凝 圍 酶 试验 取灭 菌 小 试 管 3 支 ，各 加 人 血浆 和 无 菌 水 混 合 液 （ 体 积 比 1 : 1) 0.5ml，再 分 别加
47、人 可 疑 菌 株 的 营 养 肉 汤 培 养 物 （ 或由 营 养 琼脂 培养 基 斜 面培养 物制 备 的浓菌 悬 液） 0.5mU 金 黄 色 葡萄 球菌 营 养肉 汤 培养 物 (或 由 营 养 琼 脂 培 养 基 斜 面 培 养 物 制 备 的 浓 菌 悬 液 ） 0. 5 m U 营 养 肉 汤 或 0.9% 无 菌 氯 化 钠 溶 液 0 .5m U 即为试 验 管 、 阳 性 对照管 和 阴 性 对照管。 将 3 管 同 时 培 养 ，3 小 时后 开 始观 察直至 24 小 时 。 阴 性 对照管 的 血浆 应 流 动 自 如 ， 阳 性 对照管血 漿 应 凝 固 ，若 试验
48、管血浆 凝 固 者 为血浆中国药典 2015年版 微 生 态 活 菌 制品总 论 凝 固 酶 试验 阳 性， 否 则 为 阴 性 。如 阳 性 对照管或 阴 性 对照 管 不 符 合规定 时 ，应 另 制 备 血浆 ，重新 试验。 若 上 述 疑 似 菌 为非 革 兰 氏 阳 性球菌 、血浆 凝 固 酶 试验 阴 性 ， 亦非 制品中的目的菌， 判供 试 品未 检 出 金 黄 色 葡萄 球 菌 。 S梭 菌 Clostridium) (1) 增 菌 培 养 取 供 试 品 lg，2 份 ，其 中 1 份 置 80 C 保 温 10分 钟 后 迅 速 冷 却 。上 述 2 份 供 试 品 直接
49、或 处 理后 分 别 接 种 至 9ml的 梭 菌 增 菌 培养 基 中， 置 厌 氧条件下 培养 48 小 时 。 (2) 特 异 培 养 取 上 述 每 一 培 养 物 0.1ml，分 别 涂 布 接 种 于含 庆 大 霉 素的 哥伦 比 亚 琼脂 培养 基 平 皿 上 ， 式 3 份 ，置 厌 氧条件下 培养 4872 小 时 。 (3) 结 果 判 定 阳 性 对 照 平 皿 应 长 出 典 型 的 梭 菌菌 落 。若 供 试 品 平 皿 上 未 见 菌 落 生 长 ， 判 供 试 品 未 检 出 梭 菌 ；若供 试 品平 皿 上 有菌 落 生长， 应 挑 选 2 3 个 菌 落 分 别进 行革 兰 氏染 色和 过 氧化氢 酶 试验。 过 氣 化 氩 酶 试验 取 上 述 平 皿 上 的菌 落 ，置 洁 净玻 片 上 ，滴 加 3 % 过 氧化氢试 液， 若 菌 落 表 面 有 气 泡 产 生 ， 为 过 氧化氢 酶 试验 阳 性， 否 则 为 阴 性 。 若 上 述 可 疑 菌 落 为 革 兰 氏 阳 性菌 落 ，皮 对 芽孢 的位 置 、 大 小 、形态 进 行 观 察 ，并 做适 宜 的 鉴 定 试
