1、2015/10/291基因文库及应用现代生物技术讲座西北农林科技大学园艺学院张朝红2014-11-14主要内容z 基因文库的类型z 基因组文库构建库构z cDNA基因文 库 的 构 建和 EST测序z 文库质量的评价利用z 几种表达文库构建及应用z 新一代测序（ NGS）文库制备一、基因文库的类型 基因文库的类型(一 ) 概念库：词典解释为 贮存东西的房屋或地方，如仓库、国库、库存文库（ library）： 多册成套的图书。 指一种全体的集合。基因文库（ gene library ） :是某一生物类型全部基因的集合，这些基因以克隆的形式存在（人工构建）。z 基因文库与基因库 （ gene ba
2、nk）区别z 基因文库与基因克隆基因库是指某一生物群体中的全部基因。基因克隆是只包含某些特定基因或 DNA片段的克隆。基因文库中包含着为数众多 的克隆，建成后可供随时选取其中任何一个基因克隆之用。z 构建基因文库的意义使生物的遗传信息以稳定 的重组体形式贮存起来 ;是 一 种分离克隆目的基因的主要途径 ； 种分离克隆目的基因的主要途径 ；基因文库也是复杂基因组作图的重要依据。分子生物学基本实验手段（二）基因文库的类型根据基因类型（重组 DNA片段的供体） 基因组文库和 cDNA文库1、基因组文库（ DNA文库）2、 cDNA文库2015/10/292 基因组文库(gene library)：
3、用重组 DNA技术，将某种生物细胞的总 DNA或染色体 DNA切割成一定大小的片段，并与合适的载体重组后，然后转移到适当的宿主细胞中，通过细胞增殖而构成各个片段的无性繁殖系 （ 克隆 ）， 这些存在于所有重组体内的基1、基因组文库（因组 DNA片段的集合，即基因组文库。从理论上讲它包含该生物所有基因。 根据 DNA来源可分为核基因组文库、线粒体基因组文库和叶绿体基因文库基因文库基因文库制备DNA片段基因组基因组 DNA克隆、转化、培养、鉴定克隆、转化、培养、鉴定基因文库特点及应用：包含所有遗传信息构建难度大（单拷贝基因、长片段基因）筛选难度大用于研究基因在基因组中的情况基因组物理图谱的构建基因
4、组序列分析基因在染色体上的定位基因组 DNA文库应用克隆鉴定基因调控元件基因组中基因的结构和组织形式分析物理图谱（ Physics Map）：物理图谱描绘 DNA上可以识别的标记的位置和相互之间的距离（以碱基对的数目为衡量单位 ）， 这些可以识别的标记包括限制性内切酶的酶切位点，基因等。物理图谱不考虑两个标记共同遗传的概率 等信息。对于人类基因组 来说，最粗的物理图谱是染色体的条带染色模式，最精细的图谱是测出 DNA的完整碱基序列。z亚克隆文库将人工染色体文库或粘粒文库中克隆的大片段DNA用鸟枪法 （ shot gun） 随机小片段化 然后（ ） ， 然后用这些随机小片段建立的 DNA文库20
5、15/10/293结构基因外显子内含子转录、加工修饰转录、加工修饰2、 cDNA文库mRNAcDNA 是指以 mRNA 为模板，在反转录酶的作用下形成的互补 DNA( 简称 cDNA) 。cDNA文库(complementary DNA library)以组织细胞中的mRNA为模板，反转录合成双链cDNA ，各cDNA分子分别插入载体形成重组子 ， 再导入宿主细， 再导入宿主细胞克隆扩增。这些在重组体内的cDNA的集合即cDNA文库。代表特定细胞或组织中mRAN的文库cDNAcDNA文库的构建：文库的构建：反转录酶mRNAcDNA基因重组基因重组自 20世纪 70年代中期首例 cDNA 克隆问
6、世以来，构建 cDNA 文库已成为研究功能基因组学的基本手段之一。cDNA 便于克隆和大量表达，它不像基因组含有内含子而难于表达，因此可以从 cDNA 文库中筛选到所需的目的基因，并直接用于该目的基因的表达。通过构建 cDNA 表达文库不仅可保护濒危珍惜生物资源，而且可以提供构建分子标记连锁图谱的所用探针 更重要的是可以用于分离全长基因进而，开展基因功能研究。因此， cDNA 在研究具体某类特定细胞中基因组的表达状态及表达基因的功能鉴定方便具有特殊的优势，从而使它在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和死亡调控等生命现象的研究中具有更为广泛的应用价值，是研究工作中最常使用到的基因文库。从
7、 1976年 HOFSTETTER 成功的构建了第一个 cDNA 文库以来，构建 cDNA 文库的技术方法经历了一个逐步发展完善的过程。初期 cDNA 文库，由于当时技术的限制，选用质粒载体存在着连接效率低、难以扩增和保存等缺点，而 YOUNG 和 DAVIS 重组载体为表达性文库构建和保存提供了质的飞跃。近年来， cDNA 文库构建的新方法层出不穷，但其共同目的是使 cDNA 文库更加迅速、高效满足研究的需要。z cDNA文库优点(1)使遗传物质为 RNA病毒可建立文库；(2)因克隆数比基因组文库少得多，易于筛选；(3)从分化特异的细胞的 cDNA文库中可分离到特异表达的基因。(4)建库时已
8、排除了其它的 RNA，使假阳性率减低。(5) cDNA文库可在细菌中表达，可用多种策略进行筛选。2015/10/294一个细胞在任何时间可以产生几千种不同的蛋白质，所有的蛋白质都有相应的 mRNA分子。为了鉴别其中任何一个mRNA分子，每一单独 mRNA的克隆都得考虑，但是 mRNA不能直接用于克隆，因为它很不稳定，因此，可以合成与选定组织中 所有 mRNA互补的 DNA分子 （ complementary DNAcDNA 文库便于克隆和大量扩增，可以从cDNA 文库中筛选到所需目的基因，并用于该目的基因的表达。（ DNA， cDNA）。 信息量远小于基因组文库z 注意(1) 细胞中不同 mR
9、NA的丰度不同，低丰度的 mRNA要求很高的克隆数 (要用公式来计算 )。(2)有的基因表达具有严格的时空性，要获得其 mRNA并非易事。用不同发育阶段，或不同组织细胞中的 mRNA制备的cDNA文库会包含一些共同和特异序列。这可用于分离差异表达的基因。(3)cDNA文库的 DNA无内含子、调节元件和基因间 DNA。不能用于基因结构和调节的研究。一个基因经不同的剪接可产生不同的部分重叠的 cDNA克隆。3、 cDNA文库和基因组文库的区别时效性 cDNA 文库代表某一时期特定细胞或组织中 mRAN，是转录水平，仅反映某一时期特定组织表达的功能基因，不是全部基因；而基因组文库包含该生物所有基因，
10、序列组成不同 文库无间隔序列和调控区等非编码区cDNA ；基因组文库可真实显示基因组的全部结构信息，由于制备 DNA片段的切点是随机的，所以每一克隆内所含的 DNA片段既可能是一个或几个基因，也可能是一个基因的一部分或除完整基因外还包含着两侧的邻近 DNA顺序。两种文库均有应用，如何选择根据试验目的，在分离植物 RNA、病毒基因、研究植物功能蛋白序列、 分离植物特定发育阶段或特特异表达的基因时应用 cDNA文库；在研究mRNA不存在的序列及基因组作 图时必须构建基因组文库。（三）构建文库的载体和菌株z主要有质粒、噬菌体、粘粒和人工染色体四大类，每类中由有许多不同的载体，不同的载体适于构建不同的
11、基因文库。质粒 文 库库噬菌体文库粘粒文库人工染色体文库常见构建文库的载体常见构建文库的载体1.噬菌体载体z基础：裸露的噬菌体重组DNA转化宿主细胞或包装后转染宿主细胞。z载体筛选：在细菌菌苔中形成噬菌斑。：。z重组筛选：插入载体通过可见标记的插入失活(cI基因的打断阻止溶源性，产生的噬菌体更清澈；现代的载体携带lacZ基因，以兰-白筛选)。2015/10/295置换载体Spi-表型(对P2感染敏感性消失)是中心“填充片段”gam和red基因座丢失引起的。z供体DNA的大小：插入载体：0-10kbp;置换载体：9-23kbp。插入大小范围被有效形成噬菌斑的野生型基因组75-105所限制。z主要
12、应用：插入载体:cDNA克隆和表达文库;噬菌体展示。置换载体:基因组DNA克隆。2. 粘粒(cosmid)载体z基础：包含噬菌体cos位点的质粒；z导入宿主：经体外包装，再转染宿主细胞；z载体筛选：类似于质粒z重组筛选：可见标记插入失活和小片段插入的阳性筛选；z供体DNA大小：30-45kbp。插入大小范围被有效形成噬菌斑的野生型基因组75-105所限制。z主要应用：基因组文库构建。真核基因组 DNA 取代型噬菌体载体COSCharon 4A机械剪切EcoRIEcoRI酶切加人工接头酶切连接cos cos体外包装转染 E.coli 3.3.质粒载体构建质粒载体构建cDNA cDNA文库文库双链
13、质粒 DNA 5 3AAAAAAn 加锚定引物 (寡聚 T) pBR322 5 3AAAAAn 3 5TTTT RT酶 限制酶 用 NaOH 降解 mRNA 用 Klenow 酶合成第二链 SI酶降解发夹结构 末端转移酶 dGTP 末端转移酶加寡聚 C CCC CCC GGG GGG 连接 转化 E.coli 扩增 以质粒为载体构建 cDNA 文库 4.4.大容量克隆载体大容量克隆载体基因组作图中使用的高容量人工染色体克隆载体的比较 。载体 系统 克隆容量 评价YAC(酵母人工染色体) 酵母着丝粒,复制起始点和端粒200kb2Mbp 嵌合发生率高(在基因组中不相连的连续片段)；发不稳定(自 发
14、 缺失)；很难与酵母染色体分离；PAC(P1 人工染色体) 细菌噬菌体 P1 100300kbBAC(细菌人工染色体) F 质粒 300kb稳定，但在细菌外难以维持MACs(哺乳类人工染色体)基于 Epstein-Barr 病毒的游离载体300kb人类人工游离染色体(human artificial episomal chromosome, HAEC)是一类发展中的 MACs,它来自于 Epstein-Barr 病毒(1)细菌人工染色体(bacterial artificial chromosomes, BACs, fosmids)z基础：大肠杆菌F质粒z导入宿主：电转化z载体筛选：显性选择标
15、记重组筛选：插入片段大小供体DNA大小300kb主要应用大基因大小供体大小：p主要应用：大基因组分析评论：低频率的重排和嵌合分子。载体在每个细胞中维持一个或两个拷贝，产生少量供体DNA。2015/10/296HindIIICos NotI NotIZT7 SP6ParCCMrHindIII 部分酶切ParB BACoriSParA PFGLrepE HindIIICIPPulsed-field gel electrophoresis连接 T0 T1 T2 T3 EB120 z (2) P1载体和P1人工染色体(P1 artificial chromosomes, PACs)z基础：噬菌体P1z
16、导入宿主：体外包装和转导z载体筛选：显性选择标记z重组筛选：应用对致死标记的打断进行阳性重组筛选：应用对致死标记的打断进行阳性筛选z供体DNA大小：约100kbpz主要应用：大基因组分析z评论：重排和嵌合分子少。载体维持低拷贝，但可以通过诱导噬菌体P1溶菌循环扩增。(3)酵母人工染色体(yeast artificial chromsomes, YACs)z基础：酿酒酵母中心粒、端粒和ARSz导入宿主：转化酵母原生质体z载体筛选：显性筛选标记(营养缺陷型的恢复)重选片z重组筛选：插入片段大小z供体DNA大小：2000kbpz主要应用：大基因组分析，YAC转基因小鼠z评论：YAC的缺点是高频率的自
17、发缺失，和克隆的嵌合化。重组载体的大小，需要电泳分析，有时难以区分内源性染色体。YAC维持低拷贝。CEN4 EcoRIARSISUP4TRPIAmp URA3 DNAoriEcoRI 部分酶切TEL TELBamHI BamHIBamHI和 PFEG(pulsed field gelEcoli双酶切 electrophorcsis )脉冲电泳 脉冲电泳变角电场电泳连接z 随机引物 cDNA文库和 Oligo d (T) cDNA文库依据第一链反转录引物不同分为随机引物 cDNA文库和Oligo d (T) cDNA文库。目前，随机引物 cDNA文库使用较少。Oligo d (T) cDNA文库
18、获得的克隆含有基因的 3端非翻译区。因为不含有编码序列，受到的选择压力比较小，多态性程度较高，适用于发现新的多态性 STS位点。同时可以减少文库构建过程中基因组 DNA和其它种类 RNA对文库的污染。但是传统的 Oligo d (T) cDNA文库难于获得较长基因的全长 cDNA;同时长度不等的polyA尾巴的存在会影响后期 3端测序。为此应分别通过全长库构建技术和使用锚定引物 Oligo d (T) VN或者兼并的锚定引物Oligo d(T)VN来减少 polyA长度。2015/10/297二、基因组文库的构建制备DNA片段基因重组基因重组转化细菌转化细菌体外包装体外包装（一）基因组文库构建
19、一般程序z 1. 构建基因文库的载体选用载体能够容载的 DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。载体容量越大 所要求的 DNA片断数目越少 所需的重组（1）对载体的要求（2）目前常用的载体， ，子越少。载体系列： 容量为 24 kpcosmid载体： 容量为 50 kb YAC： 容量为 1 MbBAC: 容量为 300 kb断点完全随机，片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法。（ 1）染色体 DNA大片段的制备2. 基因文库构建的一般步骤 物理切割法 ：超声波（ 300bp）或机械搅拌（ 8kb）。 物理切割法 ：内切酶进行局部消化。可得到 10-30
20、kb的随机片断。 酶切法：（ 2）载体与基因组 DNA大片段的连接 粘性末端直接连接载体与外源 DNA大片段的两个末端都有相同的粘性末端直接连接、人工接头或同聚物加尾。都有相同的粘性末端 。如： Sau3A与 BamHI的酶切末端。人工接头法（ adapter）人工合成的限制性内切酶粘性末端片断。各种酶的接头可以向公司定做或购买。接上人工接头粘性末端粘性末端CCCCCC末端转移酶 同聚物加尾2015/10/2983. 基因组文库的质量鉴定一个文库要包含 99%的基因组 DNA时所需要的克隆数目。N=ln (1-p)ln (1 f) -p: 文库包含了整个基因组 DNA的概率（ 99%）f: 插
21、入载体的 DNA片断的平均长度占整个基因组 DNA的百分数N：所需的重组载体数（克隆数）N=ln (1-p)ln (1-f)=ln (1-99%)ln (1-f)= 4.61GfN=4.61GfG Genome大小 f fragment大小例如：人的基因组是 3 109bp，插入 DNA片断的平均长度如果是 1.7 104bp： 大小 ； ： 大小N=4.61Gf=4.613 1091.7 104= 8.1 105（二）几种常见基因组文库构建1. YAC文库1.YAC文库（ Yeast artificial chromosomes YACs）利用酿酒酵母（ Saccharomyces cere
22、visiae）的染色体的复制元件构建的载体，其工作环境也是在酿酒酵母中。酿酒酵母的形态为扁圆形和卵形，生长的代时为90 分钟；含 16 条染色体，其大小为 225-1900kb ，总计有 1.4 107bp；具真核 mRNA 的加工活性。YAC 载体中最常用的是 pYAC4 为了方便制备 YAC载体， YAC 载体以环状的方式存在，并增加了普通大肠杆菌质粒载体的复制元件和选择标记，以便保存和增殖。YAC载体的复制元件 端粒重复序列端粒重复序列（ telomeric repeat ， TEL）：定位于染色体末端一段序列，用于保护线状的 DNA 不被胞内的核酸酶降解，以形成稳定的结构。 着丝粒（
23、centromere ， CEN）：有丝分裂过程中纺锤丝的结合位点， 使染色体在分裂过程中能正确分配到子细胞中 。在 YAC 中起到保证一个细胞内只有一个人工染色体的作用。如 pYAC4 使用的是酵母第四条染色体的着丝粒。 自主复制序列（ autonomously replication sequences， ARS） 一段特殊的序列，含有酵母菌中 DNA 进行双向复制所必须的信号。YAC载体的选择标记主要采用营养缺陷型基因色氨酸、亮氨酸和组氨酸合成缺陷型基因 trp 1、 leu 2和 his 3、尿嘧啶合成缺陷型基因 ura3 等，以及赭石突变抑制基因 sup4 变抑制基因带有赭石突变 a
24、de 2-1的酵母菌在基本培养基上形成红色菌落，当带有赭石突变抑制基因 sup4 的载体存在于细胞中时，可抑制 ade 2-1基因的突变效应，形成正常的白色菌落。利用这一菌落颜色转变的现象，可用于筛选载体中含有外源 DNA 片段插入的重组子。2015/10/299YAC载体的工作原理 YAC载体的优缺点缺点1、在 YAC 载体的插入片段会出现缺失 （ deletion）和基因重排 （ rearrangement） 的现象。2、容易形成嵌合体。嵌合就是在单个 YAC 中的插入片段由 2 个或多个的独立基因组片段连接组成 嵌合克隆约优点优点由 个或多个的独立基因组片段连接组成 。 嵌合克隆约占总克
25、隆的 5% 50% 。3、 YAC 染色体与宿主细胞的染色体大小相近，影响了YAC 载体的广泛应用。酵母细胞比大肠杆菌对不稳定的、重复的和极端的DNA 有更强的容忍性。2.BAC文库指一种以 F质粒（ F-plasmid）为基础建构而成的细菌染色体克隆载体，常用来克隆 150kb左右大小的 DNA片段，最多可保存 300kb个碱基对。以大肠杆菌为寄主，易培养转化率高，较其它大片段文库更易构建；环状超螺旋的存在状态，使质粒提取更为方便；BAC载体以 F因子为基础衍生而来，重组及嵌合现象少，能稳定遗传；可以通过荧光原位杂交、 PCR筛选系统等来筛选目的基因，方便快捷；在 BAC载体克隆位点两侧的
26、T7和 Sp6聚合酶启动子，可直接用于插入片段的末端测序。3.P1派生人工染色体（ PAC）P1噬菌体载体是在 P1噬菌体的基础上构建的克隆载体，用于克隆真核基因组 DNA。P1派生人工染色体（ PAC)是将 BAC和 P1噬菌体载体二者优点结合起来的克隆体系，可以克隆 100-300kb的外源 DNA片段源 片段 。（ 1）含有卡那霉素抗性基因，便于筛选。（ 2）由于其在宿主细胞中以单拷贝的形式存在，避免了因多拷贝造成的不稳定。特点4.哺乳动物人工染色体（ MAC）哺乳动物人工染色体（ MAC）指从哺乳动物细胞中分离出复制起始区、端粒以及着丝粒构建而成的克隆载体。它可以克隆大于 1000kb
27、的外源 DNA片段。应用 领域领域（ 1）有丝分裂和减数分裂对 DNA片段大小的定量分析。（ 2）研究哺乳动物细胞中染色体功能。（ 3）对复杂的基因做功能分析。（ 4）用于体细胞基因治疗2015/10/2910z 5、 Fosmid文库Fosmid文库构建应用了改进的 Cosmid质粒载体，即将pBAC引入 PUCcos融合后构建的载体系统。此载体具有如下特点： 由于插入了大肠杆菌致育因子 F-因子，所以在宿主菌中以单拷贝形式存在 ， 稳定性好 ；， ； 载体具有可诱导的 oriV高拷贝复制起始点，需要时可诱导达到高拷贝（ 50个左右）； 随机性好，保证了每段 DNA在文库中出现的频率均等；
28、插入片段的均一性好，一般在 40Kb左右。将目的 DNA用机械剪切的方法随机剪切成合适的小片段，并与载体连接构建的文库称为Shotgun文库三、 cDNA基因文库构建 及及 EST测序测序 依据起始 mRNA是否经过标准化预处理 ：非标准化 cDNA文库和标准化 cDNA文库 文库功能：克隆文库和表达文库（一） cDNA基因文库的类型 载体类型：质粒、噬菌体、粘粒和人工染色体文库 根据文库构建过程中是否对克隆进行过全长选择分为普通 cDNA文库和全长 cDNA文库 依据第一链反转录引物不同分为随机引物 cDNA文库和Oligo d (T) cDNA文库1、非标准化 cDNA文库和标准化 cDN
29、A文库z 依据起始 mRNA是否经过标准化预处理，可将文库分为非标准化 cDNA文库 ( unnormalized cDNA library)和标准化 cDNA文库 (normalized cDNA library );前者反映了组织中所有基因的表达水平，适于基因表达谱分析，但文库中冗余较高，发现新基因效率低。后者往往经过杂交（均一化）、扣除杂交(subtractive hybridization ) 抑制性扣除杂交 (suppression idization 、 subtractive hybridization )处理，不能反映建库材料的基因表达情况，不能用于表达谱构建，但是新基因发现效
30、率提高了。z 在研究基因功能和表达调控时，建立减法文库是一个很好的策略。它是通过野生行 DNA和缺失型 DNA，或不同时空、不同环境条件下的两种 cDNA样品反复杂交，去处杂交体后，将剩余的DNA或 cDNA片段进行克隆而构建的文库。2、根据文库的功能分：克隆文库和表达文库（ 1）克隆文库 由克隆载体构建，载体具有复制子、多克隆位点及选择标记 ， 可通过细菌培养使克隆片段大量增殖 。， 。克隆基因主要利用核酸探针，可用蛋白质序列或同源序列。（ 2）表达文库 由表达载体构建，载体除具有克隆载体的元件外，还具有控制基因表达的序列，如启动子、 SD序列、ATG、终止子等，可在宿主细胞内表达出克隆片段
31、的编码序列，它可分为融合蛋白表达载体和天然蛋白表达载体。分离基因时 由于克隆片段的基因表达产物蛋白质具有抗，原性和生物活性，所以除核酸探针外，还可用免疫学探针和生物功能进行筛选。表达文库适合于那些不知道蛋白质的氨基酸序列、不能用核酸类探针筛选的目的基因分离。2015/10/2911下面对几种 cDNA文库的介绍z 经典 cDNA 文库z 全长 cDNA文库z 均一化 cDNA 文库 z 差减 cDNA 文库 (Subtractive cDNA library)z 全长差减均一化 cDNA文库z 固相 cDNA 文库构建z （二）经典 cDNA 文库构建的基本原理用 Oligo(dT) 作逆转录
32、引物，或者用随机引物，给所合成的 cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。其基本步骤包括 ：（ 1） RNA 的提取 (例如异硫氰酸胍法，盐酸胍 有机溶剂法，热酚法等等，提取方法的选择主要根据不同的样品而定 )，要构建一个高质量的 cDNA 文库，获得高质量的 mRNA 是至关重要的，所以处理 mRNA 样品时必须仔细小心。由于 RNA 酶存在所有的生物中，并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境，因此建立一个无 RNA 酶的环境对于制备优质 RNA 很重要。（ 2）合成 cDNA 在获得高质量的 mRNA 后，用反转录酶Oligo(dT) 引导下合成 cDNA 第 1链， cDNA
33、 第 2链的合成 (用RNA 酶 H 和大肠杆菌 DNA 聚合酶 I，同时包括使用 T4 噬菌体多核苷酸酶和大肠杆菌 DNA 连接酶进行的修复反应 )，（ 3）合成接头的加入、将双链 DNA 克隆到载体中去、分析cDNA 插入片断 扩增 cDNA 文库 对建立的 cDNA 文库进 ， 、 行鉴定。这里强调的是对载体的选择，常规用的是 噬菌体，这是因为 DNA 两端具有由 12个核苷酸的粘性末端，可用来构建柯斯质粒，这种质粒能容纳大片段的外源 DNA。高质量 mRNA的制备反转录生成 cDNAcDNA噬菌粒文库的主要步骤：与噬菌粒载体分子相连接噬菌粒的包装1、高质量 mRNA的制备用试剂盒提取总
34、 RNA加入与生物素相连的寡聚(dT)引物温育加入与微磁球相连的抗生物素蛋白用磁场吸附通过寡聚 (dT)引物与抗生物素蛋白及强力微磁球相连的 mRNA洗脱得到 mRNA2、反转录生成 cDNA以寡聚 dT或随机6核苷酸为引物反转录酶cDNA第一链以 cDNA第一链为模板合成 cDNA第二链加接头准备与载体连接2015/10/2912为了得到有方向性的 cDNA应该接上不同的接头加入带有酶切位点的寡聚 dT引物高活性的反转录酶合成 cDNA的第一链用 RNase H分解 RNA链(5CTCGAG)合成 cDNA第二链加 Eco RI接头用 Xho I内切酶切割得到双接头有方向性的 cDNA3、与
35、噬菌体载体分子相连接带有接头的 cDNA 噬菌粒 DNA经内切酶切割含有 cDNA插入片段的重组噬菌粒 DNA4、噬菌粒的包装含有 cDNA插入片段的重组噬菌粒 DNA体外蛋白质外壳的包装反应有侵染和复制能力的成熟噬菌体进行基因组学的研究含有某种组织或器官的噬菌粒文库z经典 cDNA 文库优缺点经典 cDNA 文库的构建虽然高效、简便，但文库克隆的片段一般较小，单个克隆上的 DNA 片段太短，所能提供的基因信息很少，大多需要几个克隆才能覆盖一个完整的全基因的 cDNA。AAAAAAA mRNA(a) 随机六碱基 (b)寡聚(dT)引物第一条 cDNA 的合成An AnNNNNNN Tn(c)发
36、夹引物 (d)同聚物加尾反应第二条 cDNA 的合成TTTTTT GGGGGG TTTTTTCCCCCC加接头 1TTTTTT GGGGGG TTTTTTAAAAAA CCCCCC AAAAAA AAAAAA切除发夹 通过以下途径将 cDNA 插入载体a. 平端克隆TTTTTT b. 加接头AAAAAA c. 进一步进行同聚物加尾反应加接头 2TTTTTTAAAAAA经酶切进行定向克隆cDNA 克隆2015/10/2913（三）全长 cDNA 文库构建的原理为了克隆到真正的 cDNA 全长，建立富含全长的 cDNA 文库具有重要意义。为此，必须克服仅用 mRNA 的 Poly（ A） 尾合成以
37、及由普通逆转录酶作用特点所导致的局限性。全长 cDNA 文库，是指从生物体内一套完整的 mRNA 分子经反转录而得到的 DNA 分子群体，是 mRNA 分子群的一个完整的拷贝。全长 cDNA 文库不仅能提供完整的 mRNA 信息，而且可以通过基因序列比对得到 mRNA 剪接信息，此外，还可以对蛋白质序列进行预测及进行体外表达和通过反向遗传学研究基因的功能等。基因重组基因重组反转录酶mRNAcDNAcDNAcDNA文库的组建：文库的组建：基因重组基因重组z 反转录引物和反转录酶为了避免 oligo(dT)作为 cDNA第一链合成的引物造成的cDNA短截现象，人们对第一链引物末端的两个碱基作了改进
38、(dT) nVN，其中 V可以是 A, C或 G, N则为 A. T. C, G中的任意一种碱基，这就避免了由于 mRNA内部存在寡聚 (T)而造成的cDNA对应于 mRNA的 3端出现的短截现象。传统的逆转录酶 AMV和 MMLV等都不能逆转录出很长的cDNA .Superscript II TM(Gibco BRL)的推出，使逆转录出更长的 cDNA成为可能。 (Caminci et a1.,2000)研究表明一些糖类如海藻糖能有效提高反转录酶和其它一些酶类的活性，并能提高酶的最适反应温度，从而为打破 mRNA的二级结构，提高反转录的效率提供了可能。z 5端帽子结构真核生物的 mRNA与原
39、核生物不同，其 5端有一个特殊的甲基化帽子结构， 5端帽子结构就成为人们构建全长cDNA文库，寻找突破口的主要目标。全长 cDNA文库的构建方法都是基于 5端帽子结构的特殊性研究出来的。其中代表性的方法有 :Oligo-capping(Suzuki et a1.,1997;Marugama et a1.,1994), CAPture法 (Edery et a1.,1995),SMARTTM法 (Y.Y et a1.,2001),CAP-Trapper法法 (Y.Y 法(Carninci et a1.,1996), Capselect(Schmidt et a1.,1999 ) z Oligo-
40、capping 此方法又叫做寡聚核糖核酸单链连接法 (SSLLM ) ( Single-Strand Linker Ligation Method / SSLLM ). 1994年， Maruyama等人首先取得了突破。他们利用 5帽子的结构特点，用细菌碱性磷酸酶 (BAP)去除无 5端 mG保护的、部分降解的、不完整 mRNA末端的游离磷酸基团，再用烟草酸性磷酸酶 (TAP)去除 5的 mG结构仅保留一个 5P，合成一段寡核糖核酸，用 T4 RNA连接酶连接到经过处理的 mRNAS端的 5P上，然后利用修饰的 oligo(dT)作逆转录，并进行 PCR反应，称为 oligo capping。
41、该方法的优点在于为反转录第一链 cDNA达到全长设定了标准，从而有利于全长 cDNA的富集。理论上由于利用了 PCR技术会导致基因的拷贝数得到极大的扩增，从而利用极少量的起始材料就可以建库。该方法存在的不足有以下四点 :a.实际操作中，反应的效率比理论上的大大降低，所以需要的起始材料非常大。b.各种酶对反应模板底物有一定的倾向性，以及 PCR反应在模板的量和长度上的选择性，所以会导致在文库中某种类型的克隆的富集，因此，不能真实地反映组织中各种基因的存在情况，同时会在以后的测序反应中产生冗余性。c.各种酶反应的存在对技术难度的要求比较大，模板长时间的暴露在酶反应中会使降解的风险性加大，不利于得到
42、高质量的库。d.由于连接时要用到 RNA连接酶，一般来讲 RNA连接酶没有DNA连接酶的效率高，所以连接效率的高低也会直接影响到文库的质量。2015/10/2914z CAPture法Ederly等 (1995)报道了一种称为 CAPture的方法，据称能够非常有效地建立全长的。 DNA文库。他们利用“帽结合蛋白”专门结合 mRNA的帽结构，含有完整帽子结构的 mRNA被富集，逆转录后用 RNase作用于 mRNA/DNA杂合子，未被帽结合蛋白结合的部分降解”的不完整 mRNA，有一些虽结合了“帽结合蛋白”但 DNA并不完整的 mRNA都被降解，仅完整 mRNA又有全长 cDNA第一链结合保护
43、的那些 mRNA被保护，进一步纯化富集后建库，获得的克隆全长比例很高，但每次需极其大量的mRNA(1OOug)，另外，被帽结合蛋白结合的 mRNA 5端约 10-50bp被丢失。所以严格来讲所谓的全长 cDNA文库并不是全长的。此技术的优点是 :特异地对 5帽子进行筛选，目的性更强 ;整个过程对 mRNA的酶促反应较少，降低了 mRNA被降解的风险，有利于得到全长的。 DNA克隆，从而使文库中全长的比例很高 ;不进行 PCR反应，基因的冗余性大大降低。此技术的缺点是效率和产量很低 ， 需要的起始材料的量非，常大，不利于有限材料的建库 ;模板 mRNA 5端的二级结构对帽结合蛋白的有效性有着非常
44、大的影响，从而会导致某一种类型的 mRNA的富集，使文库的克隆产生偏向性 ;被帽结合蛋白结合的 mRNA 5末端约 10-5Obp的碱基被丢失，不利于分析。zSMART法SMART法 (Switching Mechanism at 5 End of RNA Transcript SMART ) CLONTECH公司推出的试剂盒 Cap Finder(现又命名为 SMARTTM）是利用帽子结构特征。 SMART法充分利用了反转录酶 PowerscriptTMRT末端转移酶活性和限制性内切酶 sfi的特性。 PowerscriptTMRT是 MMLU反转录酶经过点突变而得来的，它丧失了 RNase
45、H活性，但仍然保留着野生型的聚合酶活性，并且具有较好长距离反转录能力，另外它还具有在双链核酸的 3端添加 oligo(dC)的末端转移酶活性。实验设计时，在合成第一链 cDNA的 oligo(dT)引物的 5端加上了 Sfil (A)的识别位点。当反转录达到 mRNA的 5端时，借助 PowerscriptTMRT的末端转移酶活性，可以在全长的cDNA末端加上几个 (dC)，而截短的 cDNA，由于反转录延伸没有达到 mRNA的 5端， PowerscriptTMRT不能以它为底物在截短的 cDNA末端加上 oligo(dC)，所以在合成第二链时，带有 sfi (B)的 oligo(dG)引物
46、不能与它结合，不能合成第二链，因此，理论上所得到的 dsDNA都是全长 cDNA。全长dscDNA在经限制性内切酶 Sfil切割，由于两端的粘性末端不同，所以可以实现对目的基因的定向克隆。SMART cDNA Synthesis2015/10/2915该方法的优点在于不存在对 mRNA进行处理的酶促反应，不仅操作简单，而且一定程度上提供了全长 cDNA合成的可能性。但是，该方法也存在以下不足 :a.理论上，只有当反转录第一链 cDNA到达模板 mRNA的 5末端帽子结构时，末端转移酶活性才能发生，但实际上，在反转录并未到达帽子结构就终止的第 链 DNA的末端 反转录一 链 c ，酶末端转移酶的
47、活性照样表达，因此，文库中会有一定数量的非全长克隆，不利于以后的分析研究。b.末端转移酶活性低，加 dC量小，从而导致在 CapSwitch这一步中，寡核昔酸作为模板的效率不高，导致克隆的丢失。z CAP-Trapper法CAP-Trapper法 该方法首先由 Carninci (1996)等报道。CAP-Trapper法合成全长的原理是 :依据 mRNA的 5端和 3端存在的二醇结构来开展工作。首先将二醇结构进行氧化，在进行生物素修饰之后经过沉淀、酒精洗涤、无 RNase的灭菌水重新悬浮等筛选步骤，得到生物素化的 mRNA经逆转录酶催化进行cDNA第 一 链的合成 ， 接着进行 RNase 1处理 ， 未被 cDNA保护链的合成 ， ，的 mRNA(包括非全长 cDNA与 RNA杂交体中暴露的 mRNA 5端及所有的未被 cDNA保护的 mRNA)即被降解。经链青霉素磁珠吸附并使用弱碱降解 mRNA，如此得到单链 cDNA，在末端转移酶的作用下进行 5端 Oligod(G)加尾，之后再进行第二链的合成，连接载体即可得到全长 cDNA文库。这种方法后来又进行了许多改进。该方法的优点在于 :直接对全长 mRNA进行筛选，最后得到的cDNA理论上主要是全长 cDNA。该技术的缺点也比较明显 :a. NaI04氧化这
