1、Chine se Journal of Practi cal Stoma tol ogy Mar. 2010 Vol. 3 No. 3 白 色 念 珠 菌 （ Candi da albi cans ） 又 称 白 色 假 丝 酵 母 菌 ， 是 口 腔 常 见 菌 群 ， 也 是 口 腔 中 重 要 的 条 件 致 病 性 真 菌 。 在 不 同 年 龄 阶 段 人 群 的 口 腔 中 ， 可 不 同 程 度 地 检 出 白 色 念 珠 菌 1 。 已 有 的 研 究 发 现 变 形 链 球 菌 （ Strep toc occ us mutans ） 为 光 滑 面 龋 的 主 要 致 病 菌
2、 ， 发 酵 糖 类 产 生 乳 酸 ； 发 酵 乳 酸 杆 菌 （ Lacto baci llus ferme ntum ） 为 牙 本 质 龋 的 主 要 致 病 菌 ， 是 牙 菌 斑 中 最 常 见 的 乳 杆 菌 ， 发 酵 糖 类 产 生 乙 酸 。 现 在 很 多 食 品 厂 家 用 山 梨 糖 、 木 糖 醇 等 变 形 链 球 菌 不 能 利 用 的 糖 类 来 制 作 抑 龋 食 品 2 。 白 色 念 珠 菌 不 仅 可 发 酵 蔗 糖 、 葡 萄 糖 、 麦 芽 糖 等 糖 类 产 酸 ， 甚 至 包 括 山 梨 醇 、 木 糖 醇 等 多 种 变 形 链 球 菌 不
3、能 分 解 利 用 的 糖 类 。 且 白 色 念 珠 菌 产 酸 溶 解 羟 基 磷 灰 石 的 能 力 是 变 形 链 球 菌 的 20 倍 左 右 3 。 因 此 ， 白 色 念 珠 菌 可 能 参 与 致 龋 作 用 ， 其 与 变 形 链 球 菌 、 发 酵 乳 酸 杆 菌 在 牙 菌 斑 中 是 否 竞 争 营 养 物 质 和 空 间 位 置 ， 对 口 腔 微 生 物 动 态 平 衡 和 研 究 龋 病 的 流 行 病 学 具 有 十 分 重 要 的 意 义 。 本 实 验 通 过 检 测 受 检 者 牙 菌 斑 中 白 色 念 珠 菌 、 变 形 链 球 菌 、 发 酵 乳 酸
4、 杆 菌 的 阳 性 表 达 ， 分 析 它 们 的 共 栖 关 系 ， 为 进一步研究龋病的防治提供理论基础。 1 资料与方法 1 . 1 研 究 对 象 选 择 2007 年 9 10 月 辽 宁 中 医 药 大 学 职 业 技 术 学 院 职 工 和 学 生 119 人 。 男 47 人 ， 女 72 人 ； 年 龄 3 81 岁 ， 平 均 37 . 8 岁 。 受 检 者 均 知 情 同 意 ， 自 愿 参 加 本 项 研 究， 3 个月内未使用抗生素 、 皮质激素等免疫抑制药物。 1 . 2 主 要 试 剂 溶 菌 酶 （ Amresco ， US ） ， 蛋 白 酶 K （ Me
5、rk ， Germany ） ， 溶 细 胞 壁 酶 （ Sigma ， US ） ， Tris 、 EDTA 、 SDS （ Sig - ma ， US ） ， dNTP （ Roche ， Swit zerla nd ） ， TaqE （ TaKaRa ， 大 连 宝 生 物 工 程 有 限 公 司 ） ， gene find er 核 酸 染 料 （ Bio -V ， 厦 门 百 维 信 生 物 科 技 有 限 公 司 ） ， DNA 分 子 量 标 准 为 DL 2000 Marke r 作者单位： 沈阳市口腔医院牙体牙髓科 ， 沈阳 110002 电子信箱： lei shuhao 1
6、26 .com 论 著 口腔白色念珠菌与主要致龋菌相关性分析 文章编号： 1674 - 1595 （2010 ） 03 - 0170 - 03 中图分类号： 78 文献标志码： 赵英姿 ， 宫雁冰 摘 要 ： 目 的 分 析 口 腔 白 色 念 珠 菌 与 主 要 致 龋 菌 关 系 。 方 法 选 择 2007 年 9 10 月 辽 宁 中 医 药 大 学 职 业 技 术 学 院 职 工 和 学 生 119 人 ， 采 集 其 口 腔 牙 菌 斑 ， 用 PCR 法 检 测 白 色 念 珠 菌 、 变 形 链 球 菌 和 发 酵 乳 酸 杆 菌 阳 性 表 达 ， 分 析 其 相 关 关 系
7、 。 结 果 白 色 念 珠 菌 、 变 形 链 球 菌 、 发 酵 乳 酸 杆 菌 阳 性 率 分 别 为 28 . 6 % （ 34 119 ） ， 62 . 2 % （ 74 119 ） ， 10 . 9 % （ 13 119 ） 。 变 形 链 球 菌 在 白 色 念 珠 菌 阳 性 者 中 检 出 率 （ 16 34 ， 47 . 1 % ） 低 于 白 色 念 珠 菌 阴 性 者 （ 58 85 ， 68 . 2 % ） ， 差 异 有 统 计 学 意 义 ， 呈 负 相 关 （r = - 0 . 197 ， P = 0 . 032 ） 。 发 酵 乳 酸 杆 菌 在 白 色 念
8、珠 菌 阳 性 者 中 检 出 率 与 在 白 色 念 珠 菌 阴 性 者 中 检 出 率 差 异 无 统 计 学 意 义 （P 0 . 05 ） 。 结 论 口 腔 白 色 念 珠 菌 与 变 形 链 球 菌 可 能 有 拮 抗 关 系， 与发酵乳酸杆菌无拮抗关系。 关键词： 白色念珠菌 ； 变形链球菌 ； 发酵乳酸杆菌 ； 龋病 The correlation between oral Candida albicans and putative cariogenic bacteria. ZHAO Ying-zi ， GONG Yan-bing. Department of Endodont
9、ics ， Stomatology Hospital of Shenyang ， Shenyang 110002 ， China Abstract ： Objective To explor e the relat ionship between oral Candida albicans and putative cario genic bacter ia. Methods A total of 119 dental plaque sample s were collect ed. PCR method was prefor med for identific ation of Candid
10、a albicans ， Strepto coccus mutans ， Lactoba cillus ferm entum. Analyze the corr elation among them. Results The positiv e rate of Candida albicans ， Strepto coccus mutans ， and Lactoba cillus ferm entum was 28. 6% （ 34119 ） ， 62 . 2 % （ 74119 ） and 10. 9% （ 13 119 ） ， respe ctively . The prese nce
11、of Strepto coccus mutans in Candida albicans carr iers ( 47 . 1 % ， 1634 ） was signifi cantly lower than non-Candida albicans carr iers （ 68 . 2% ， 5885 ） . Candida albicans carr iage was negative ly corr elated with the prese nce of Strepto coccus mutans （r = - 0. 197， P = 0 . 032 ） . No corr elati
12、on was found between Candi da albicans carr iage and Lactoba cillus ferm entum detected （P 0 . 05 ） .Conclusion Oral Candida albicans and Strepto coccus mutans may have antagonis tic relat ionship. Keywords ： Candida albicans ； Strepto coccus mutans ； Lactoba cillus ferm entum ； dental carie s 170中国
13、实用口腔科杂志 2010 年 3 月第 3 卷第 3 期 （ 大 连 宝 生 物 工 程 有 限 公 司 ） 。 引 物 设 计 参 照 文 献 4 - 6 ， 购于上海生工生物工程技术服务有限公司。见表 1 。 1 . 3 研究方法 1 . 3 . 1 样 本 采 集 用 无 菌 牙 签 采 集 后 牙 邻 间 隙 牙 菌 斑 样 品， 立即悬浮于 100 L 生理盐水中， - 20 保存。 1 . 3 . 2 牙 菌 斑 DNA 提 取 参 照 文 献 4 ， 常 规 酚 - 氯 仿 法 提取 DNA 。 1 . 3 . 3 PCR 扩 增 PCR 反 应 体 系 （ 20 L ） ： H
14、 2 O 14 . 5 L ， 10 buff er 2 . 0 L ， 10 mmol L dNTP 0 . 5 L ， 10 mol L 上 游 引 物 和 下 游 引 物 各 0 . 5 L ， 5 U L TaqE 0 . 2 L ， 牙 菌 斑 DNA 模 板 1 . 8 L 。 循 环 条 件 ： 95 热 启 动 5 min ； 95 30 s ， 退 火 30 s （ 退 火 温 度 ： 白 色 念 珠 菌 和 乳 酸 杆 菌 均 为 50 ， 变 形 链 球 菌 为 55 ） ， 72 30 s ， 40 个 循 环 ； 72 10 min 。 4 保 存 。 2 . 0 %
15、 琼 脂 糖 ， 1 TBE 缓 冲 液 ， gene find er 核 酸 染 料 染 色 ， 电 泳 （ 110 V ） 30 min 。 紫 外 线 凝 胶 扫 描 成 像， 并记录实验结果。 1 . 4 统 计 学 处 理 采 用 SPSS 11 . 5 统 计 软 件 对 数 据 进 行 pearso n 2 检 验 、 Kenda ll 等 级 相 关 分 析 ， 对 PCR 检 测 结 果 进 行比较分析。P 0 . 05 为差异有统计学意义 。 2 结果 2 . 1 3 种 细 菌 PCR 检 测 结 果 受 检 者 牙 菌 斑 中 ， 白 色 念 珠 菌 阳 性 表 达 率
16、 为 28 . 6 % （ 34 119 ） ， 其 PCR 检 测 结 果 见 图 1 ； 变 形 链 球 菌 阳 性 表 达 率 为 62 . 2 % （ 74 119 ） ， 其 PCR 检 测 结 果 见 图 2 ； 发 酵 乳 酸 杆 菌 阳 性 表 达 率 为 10 . 9 % （ 13 119 ） ， 其 PCR 检测结果见图 3 。 2 . 2 白 色 念 珠 菌 与 变 形 链 球 菌 相 关 性 分 析 变 形 链 球 菌 在 白 色 念 珠 菌 阳 性 者 检 出 率 为 47 . 1 % （ 16 34 ） ， 在 白 色 念 珠 菌 阴 性 者 检 出 率 为 68
17、. 2 % （ 58 85 ） ， 经 pearso n 2 检 验 ， 差 异 有 统 计 学 意 义 （ 2 = 4 . 631 ，P = 0 . 0031 ） ； 经 Kenda ll 等 级 相 关 分 析 ， 与 白 色 念 珠 菌 呈 负 相 关 （r = - 0 . 197 ， P = 0 . 032 ） 。 2 . 3 白 色 念 珠 菌 与 发 酵 乳 酸 杆 菌 相 关 性 分 析 发 酵 乳 酸 杆 菌 在 白 色 念 珠 菌 阳 性 者 检 出 率 为 14 . 7 % （ 5 34 ） ， 在 白 色 念 珠 菌 阴 性 者 检 出 率 为 9 . 4 % （ 8 8
18、5 ） ， 经 pearso n 2 检 验 ， 差异无统计学意义 （ 2 = 0 . 699 ， P = 0 . 403 ） 。 3 讨论 白 色 念 珠 菌 属 于 真 菌 界 半 知 菌 亚 门 - 芽 孢 菌 纲 - 隐 球 酵 母 目 - 隐 球 酵 母 科 - 念 珠 菌 属 ， 是 双 相 型 单 细 胞 酵 母 菌 。 目 前 认 为 只 有 8 种 念 珠 菌 能 引 起 人 或 动 物 的 感 染 ， 均 为 条 件 致 病 菌 ， 其 中 主 要 是 白 色 念 珠 菌 。 健 康 人 的 口 腔 、 阴 道 、 消 化道 等处 均可 带此 菌 。 在普 通无 症状 人群
19、 中白 色念 珠菌 阳 性 率 为 22 % 70 % ， 有 报 道 口 腔 白 色 念 珠 菌 阳 性 率 在 新 生 儿 中 为 45 % ， 健 康 儿 童 为 45 % 65 % ， 健 康 成 人 为 30 % 45 % ， 戴 可 摘 活 动 义 齿 者 为 50 % 65 % 7 。 白 色 念 珠 菌 能 够 分 解 多 种 糖 类 ， 产 酸 能 力 远 远 高 于 已 明 确 为 致 龋 菌 的 变 形 链 球 菌 ， 还 能 利 用 变 形 链 球 菌 不 能 利 用 的 糖 类 产 酸 3 。 有 报 道 4 12 岁 有 龋 儿 童 的 白 色 念 珠 菌 检 出
20、率 高 于 无 龋 儿 童 8 。 35 92 岁 患 根 面 龋 中 老 年 人 的 白 色 念 珠 菌 检 出 率 较 高 9 。 可 见 ， 口 腔 白 色 念 珠 菌 可 能 参 与 龋 病 发 生 、 进 展 过 程。 白 色 念 珠 菌 作 为 口 腔 正 常 菌 群 ， 与 口 腔 中 的 其 他 微 生 引物序列 PCR 产物 （ bp ） 白色念珠菌 上游 （ F ） ： GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 250 下游 （ R ） ： GCTGCGTTCTTCATCGATGC 变形链球菌 上游 （ F ） ： TCTAAGCAAGAAGC TGCTAGTAGT 1
21、50 下游 （ R ） ： TGGTTGAGATGT TGCTGAAGTTGC 发酵乳酸杆菌 上游 （ F ） ： AATACCGC ATTACAACTTTG 337 下游 （ R ） ： GGTTAAATACCGTCAACGTA 表 1 3 种细菌的 PCR 引物序列及产物大小 M 为 DNA marker ； 1 24 为 不 同 样 本 PCR 产 物 ； 250 bp 条 带 （ 样本 5 、 6 、 7 、 8 、 11 、 、 23 、 24 ） 为白色念珠菌阳性 。 图 1 白色念珠菌 PCR 检测结果 250 bp M 1 6 12 18 24 M 为 DNA marker ；
22、 1 24 为 不 同 样 本 PCR 产 物 ； 337 bp 条 带 （ 样 本 3 、 7 、 9 ） 为发酵乳酸杆菌阳性 。 图 3 发酵乳酸杆菌 PCR 检测结果 M 为 DNA marker ； 1 24 为 不 同 样 本 PCR 产 物 ； 150 bp 条 带 （ 样 本 1 、 2 、 5 、 6 、 9 12 、 14 18 、 20 、 22 ） 为变形链球菌阳性 。 图 2 变形链球菌 PCR 检测结果 150 bp 1 6 12 18 24 M 337 bp M 1 6 12 18 24 171Chine se Journal of Practi cal Stoma
23、 tol ogy Mar. 2010 Vol. 3 No. 3 物 共 同 作 用 ， 相 互 黏 附 ， 对 维 持 口 腔 中 的 微 生 态 平 衡 有 重 要 作 用 。 有 研 究 表 明 ， 血 链 球 菌 （ Strep toc occ us sangui s ） 、 戈 登 链 球 菌 （ Strep toc occ us gordo nii ） 、 口 链 球 菌 （ Strep toc occ us oral is ） 、 唾 液 链 球 菌 （ Strep toc occ us sali vari us ） 均 能 与 白 色 念 珠 菌 形 成 共 聚 体 ， 而 变
24、形 链 球 菌 不 能 与 白 色 念 珠 菌 形 成 共 聚 体 10 。 本 研 究 也 发 现 ， 变 形 链 球 菌 在 白 色 念 珠 菌 阳 性 者 中 的 检 出 率 （ 47 . 1 % ） 显 著 低 于 其 在 白 色 念 珠 菌 阴 性 者 中 的 检 出 率 （ 68 . 2 % ） 。 由 此 推 测 二 者 可 能 存 在 拮 抗 作 用 ， 具 体 拮 抗 因 素 尚 需 进 一 步 研 究 。 由 于 白 色 念 珠 菌 亦 为 产 酸 菌 ， 其与变形链球菌的拮抗关系并不影响其致龋作用。 牙 本 质 龋 的 重 要 致 龋 菌 为 乳 酸 杆 菌 ， 与 白
25、色 念 珠 菌 则 未 见 拮 抗 关 系 。 本 实 验 中 ， 发 酵 乳 酸 杆 菌 在 白 色 念 珠 菌 阳 性 者 中 的 检 出 率 （ 14 . 7 % ） 略 高 于 其 在 白 色 念 珠 菌 阴 性 者 中 的 检 出 率 （ 9 . 4 % ） ， 但 无 统 计 学 意 义 。 其 他 学 者 也 有 类 似 报 道 ， Strah inic 等 11 取 牙 菌 斑 进 行 16 S rDNA 的 PCR 检 测 ， 发 现 发 酵 乳 酸 杆 菌 与 变 形 链 球 菌 有 拮 抗 作 用 ， 与 白 色 念 珠 菌 无 拮 抗 作 用 。 但 女 性 子 宫 颈
26、 阴 道 涂 片 检 查 发 现 ， 在 念 珠 菌 阳 性 者 乳 酸 杆 菌 检 出 率 更 高 ， 念 珠 菌 生 长 与 乳 酸 杆 菌 呈 正 相 关 12 。 白 色 念 珠 菌 与 乳 酸 杆 菌 在 感 染 根 管 中 常 可 共 同 检 出 13 。 由 此 推 测 ， 白 色 念 珠 菌 与 发 酵 乳 酸 杆 菌 可 以 形 成 共生关系， 共同参与龋病发展过程 。 本 研 究 中 白 色 念 珠 菌 阳 性 者 ， 其 变 形 链 球 菌 阳 性 率 （ 47 . 1 % ） 高 于 发 酵 乳 酸 杆 菌 阳 性 率 （ 14 . 7 % ） ， 这 可 能 是 由
27、于 本 实 验 取 材 部 位 为 后 牙 邻 间 隙 ， 为 光 滑 面 牙 菌 斑 ， 变 形 链 球 菌 含 量 较 大 。 而 乳 酸 杆 菌 多 位 于 窝 沟 龋 ， 在 光 滑 面 数 量 较 少 2 。 故 本 研 究 的 发 酵 乳 酸 杆 菌 检 出 率 低 于 变 形 链 球 菌。 以 上 研 究 表 明 ， 白 色 念 珠 菌 与 光 滑 面 致 龋 菌 变 形 链 球 菌 呈 负 相 关 ， 与 牙 本 质 龋 致 龋 菌 发 酵 乳 酸 杆 菌 无 拮 抗 关 系 。 白 色 念 珠 菌 可 与 发 酵 乳 酸 杆 菌 共 同 参 与 龋 病 的 发 展 过 程 。
28、 因 此 ， 龋 病 的 预 防 药 物 、 致 龋 糖 类 替 代 品 的 研究， 应更多地注意宿主口腔微生态平衡的问题。 参考文献 1 亓 庆 国 ， 周 学 东 ， 肖 晓 蓉 ， 等 . 正 常 儿 童 口 腔 中 白 色 念 珠 菌 的 分 布 及 基 因 分 组 J . 中 华 微 生 物 学 和 免 疫 学 杂 志 ， 2003 ， 23 （ 9 ） ： 674 - 677 . 2 樊 明 文 . 牙 体 牙 髓 病 学 M . 北 京 ： 人 民 卫 生 出 版 社 ， 2000 ： 21 - 31 . 3 Nikaw a H ， Yamashiro H ， Maki hira
29、 S ， et al. In vit ro cari oge nic po - tent ial of Candi da albi cans J . Myc oses ， 2003 ， 46 （ 11 - 12 ） ： 471 - 478 . 4 周 曾 同 ， 赵 民 ， 张 济 ， 等 . 口 腔 白 色 念 珠 菌 的 PCR ITS 1 -ITS 2 基 因 分 型 法 的 建 立 及 应 用 J . 实 用 口 腔 医 学 杂 志 ， 2006 ， 22 （ 1 ） ： 60 - 63 . 5 林 焕 彩 ， 支 清 蕙 ， 杨 军 英 ， 等 . 变 链 菌 葡 糖 基 转 移 酶
30、 遗 传 多 态 性 与 乳 牙 高 龋 的 关 系 J . 现 代 口 腔 医 学 杂 志 ， 2007 ， 21 （ 5 ） ： 455 - 458 . 6 Dick son EM ， Rigg io MP ， Mac pherson L. A nove l speci es-speci fic PCR assay for iden tif ying Lacto baci llus ferme ntum J . J Med Mic robio l ， 2005 ， 54 （ Pt 3 ） ： 299 - 303 . 7 Akpan A ， Morg an R. Oral candi dia
31、si s J . Postgra d Med J ， 2002 ， 78 ： 455 - 459 . 8 Ugun-Ca n B ， Kadi r T ， Ak y z S. Oral candi dal carri age in chil - dren wit h and wit hout dent al cari es J . Quint essence Int ， 2007 ， 38 （ 1 ） ： 45 - 49 . 9 Zaremba ML ， Dani luk T ， Rozkie wic z D ， et al. Incid ence rate of Candi da speci
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33、9 - 1436 . 11 Strah inic I ， Busarc evi c M ， Pavli ca D ， et al. Mol ecul ar and bio - chemi cal chara cte rizat ions of human oral lac toba cil li as puta tiv e probi oti c candi date s J . Oral Mic robio l Immunol ， 2007 ， 22 （ 2 ） ： 111 - 117 . 12 Demire zen S. The Lacto baci lli -Candi da rela
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