分享
分享赚钱 收藏 举报 版权申诉 / 21

类型western-blot-实验技术及原理.ppt

  • 上传人:无敌
  • 文档编号:1111030
  • 上传时间:2018-06-12
  • 格式:PPT
  • 页数:21
  • 大小:297.52KB
  • 配套讲稿:

    如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。

    特殊限制:

    部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。

    关 键  词:
    western-blot-实验技术及原理.ppt
    资源描述:

    1、Western blot 实验技术,定义:,印迹法(blotting)是指将样品转移到固相载体上,而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年,Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜(NC膜)上,并利用DNARNA杂交检测特定的DNA片段的方法,称为Southern印迹法。而后人们用类似的方法,对RNA和蛋白质进行印迹分析,对RNA的印迹分析称为Northern印迹法,对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法,对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法,Western Blot基本原理,在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体

    2、,然后用这种多肽的特异抗体来检测。,Western Blot一般流程,蛋白样品的制备SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳,转膜封闭一抗杂交二抗杂交底物显色,通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白水溶液提取法 针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液 对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂 。 细胞裂解液: 50 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L Nacl ,5 mmol/L EDTA, 1%NP40 , 0.05% PMSF , 2g/mL Aprotinin, 0.5g/mL Leupeptin , pH8.0 有机溶剂提取法 对于分子中非极性侧链较多的

    3、蛋白质可用有机溶剂提取,包括乙醇、 丙酮和丁醇等。通过层析或电洗脱法制备目的蛋白,蛋白样品的制备,蛋白样品的定量,Bradford法 考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式,在一定浓度的乙醇和酸性条件下,可配成淡红色的溶液,与蛋白结合后形成蓝色化合物,该化合物在595nm处有最大吸收值,化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比 。(上样量)试剂:考马斯亮蓝工作液,0.1N盐酸,双蒸水,蛋白标准液( 将10mg/ml蛋白溶液稀释至4.0mg/ml, 3.5mg/ml, 3.0mg/ml, 2.5mg/ml, 2.0mg/ml, 1.5mg/ml, 1.0mg/ml, 0.5mg/ml。),S

    4、DS聚丙烯酰胺凝胶电泳,原理: SDS 是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水性的长碳链.当 SDS 与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用.大多数蛋白质和 SDS 的平均结合量是 1:1.4 (以重量为单位),而蛋白质结合固定比例之 SDS 後,由於 SDS 带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道,且每单位重量之蛋白质带电价一致 (charge density),所以决定不同蛋白的泳动速率就只剩下分子大小一项因素,丙烯酰胺和N,N-亚甲双丙烯酰胺 SDS配胶的Tris缓冲液TEMED过硫酸铵(时间)Tris-

    5、甘氨酸电泳缓冲液,凝胶成份,凝胶浓度与蛋白分离范围,转膜,半干法将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿润滤纸之间,电转1030min。湿法将凝胶和固相基质夹在滤纸中间,浸泡在转移装置的缓冲液中,电转45min或过夜。,转膜后检测,丽春红S染色蛋白带出现后,于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤膜,换水几次。印度墨汁染色只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探针的Western印迹过程。,封闭,脱脂奶粉(5)BSAWestern Blot 膜封闭液(生物试剂公司提供),一抗、二抗孵育,把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中,根据滤膜面积以0.1ml/cm2的量加入加入一抗溶液与滤膜温育。37一

    6、小时,4 过夜。倒掉一抗溶液,用PBS漂洗液滤膜3次,每次10min。加入用封闭液配制的二抗,摇床上缓慢摇动, 37一小时,4 过夜。倒掉一抗溶液,用PBS漂洗液滤膜3次,每次10min。,二抗与底物反应显色,辣根过氧化物酶法(HRP)碱性磷酸酶法(AP)化学发光显色法(HRP),Western Blot常见问题分析,SDS-PAGE电泳,胶不平?凝胶漏液?,胶板洗刷干净加入APS和TEMED的量要合适加入试剂后摇匀,使其充分混合,防止部分胶块聚合不均匀温度合适,受热不均匀导致胶聚合不均匀两块玻璃板底部要对齐,条带比正常的窄?“微笑”或“倒微笑”条带?,凝胶聚合不均匀,灌胶时候尽量混合均匀,动作轻缓拔梳子要迅速,清洗加样孔要小心,以免把上样带扭曲样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一,纯化样品,调整盐浓度胶板底部有气泡会影响电泳效果,应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适,转膜及抗体检测,凝胶肿胀或卷曲?条带歪斜或漂移?单个或多个白点?转膜缓冲液过热?,可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min电转仪长期使用导致海绵变薄,“三明治”结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通的草纸确保膜和胶块之间没有气泡缓冲液中离子浓度太低,电流或电压太高。转膜过程注意降温,背景太高,

    展开阅读全文
    提示  道客多多所有资源均是用户自行上传分享,仅供网友学习交流,未经上传用户书面授权,请勿作他用。
    关于本文
    本文标题:western-blot-实验技术及原理.ppt
    链接地址:https://www.docduoduo.com/p-1111030.html
    关于我们 - 网站声明 - 网站地图 - 资源地图 - 友情链接 - 网站客服 - 联系我们

    道客多多用户QQ群:832276834  微博官方号:道客多多官方   知乎号:道客多多

    Copyright© 2025 道客多多 docduoduo.com 网站版权所有世界地图

    经营许可证编号:粤ICP备2021046453号    营业执照商标

    1.png 2.png 3.png 4.png 5.png 6.png 7.png 8.png 9.png 10.png



    收起
    展开