1、TOPO 克隆技术与基因定点突变技术,北京全式金生物技术有限公司 ,背景资料,基因克隆是分子生物学必不可少的工具，传统的T4 DNA Ligase方法实验周期长。 TOPO克隆5分钟快速克隆，是克隆技术的革命。这个技术上的飞跃为实现“加速科研”的理念提供了先决条件。 基因定点突变技术改造基因的便利方法。基因功能研究已经成为生命科学研究的新热点，因此需要强有力的工具保证基因结构和功能关系研究的进行。,TOPO克隆技术,TOPO克隆原理 TOPO克隆策略 TOPO克隆成功的关键 TOPO克隆常见问题及解决方法,TOPO克隆原理,TOPO即Topoisomerase 拓扑异构酶 特点： 由316个氨
2、基酸组成 识别5-CCCTT-3 同时具有限制性内切酶和连接酶的功能 不需要能量,TOPO克隆原理,TOPO克隆过程,TOPO克隆过程,TOPO克隆迅速、便捷,TOPO克隆克隆策略,有无杂带？有无引物二聚体？,基因克隆、转化,TOPO克隆和传统T4克隆比较,TransGen TOPO Vector,pEASY-T1 Cloning Vetor pEASY-T1 Simple Cloning Vetor pEASY-T3 Cloning Vetor pEASY-Blunt Cloning Vetor pEASY-Blunt Simple Cloning Vetor pEASY-E1 Expres
3、sion Vetor pEASY-E2 Expression Vetor,克隆载体图谱TA Cloning,克隆载体图谱Blunt Cloning,表达载体TA Cloning,一步法载体构建藉由TOPO技术实现!,TOPO克隆成功的关键,引物设计 PCR条件 克隆反应设置（DNA加入量、反应的温度和时间） 克隆感受态细胞的选择 选用质量好的胶回收或PCR纯化试剂盒,引物设计：引物不能磷酸化；引物5端第一个碱基会影响下游的连接效率；PCR注意事项：后延伸设置为721020分钟；目的：保证扩增片段完整，可以有效降低扩增背景；使用Taq系列DNA聚合酶扩增时，该步骤相当于加A反应。,目的片段加入量
4、为保证良好的连接效率，推荐如下 700bp以及更小的片段：保证20ng 700bp以上的片段：保证30100ng 2Kbp左右的片段：保证40ng 3Kbp左右的片段：保证60ng片段加入量max：4l，浓度很低时也有一定的连接效率，体积大于5 l会破坏反应体系平衡；片段加入量min：0.5l，浓度很高时需要稀释，可以补充无菌水方便操作。反应温度：TOPO酶的工作温度为2037,反应时间：,克隆感受态细胞的选择：,选择质量好的胶回收或PCR纯化试剂盒：试剂品质很关键质量不好的试剂盒很可能会抑制下游连接,TOPO克隆常见问题及解决方法,克隆数少（确认感受态细胞效率正常时） 克隆阳性率低 PCR鉴
5、定重组子失败 菌落多为淡蓝色或FishEye（白边蓝芯）,克隆数少或阳性率低：,上述五种情况，均需要适当延长连接反应时间！以保证连接效率和克隆数。（可参考上文的载体连接反应时间）另外每种情况也有一些特别的地方可以改进，进一步提高克隆效果。,PCR产物不新鲜： Why 3端热力学不稳定，3“A”容易脱落直接导致TA克隆效率低 How PCR产物置于4保存12天内使用不要冷冻PCR产物PCR结束后立即使用效果最好,克隆胶回收片段： Why 紫外照射和EB对dsDNA造成损伤； (受到损伤的DNA不是连接的最佳底物)3-“A”容易在电泳过程中被核酸外切酶降解，导致TA连接效率低；试剂残留的抑制。 H
6、ow 操作中通过细节注意避免,目的片段浓度很低： Why 无法保证有效碰撞 How 浓缩DNA,毒基因： Why其本底表达产物对宿主生长有明显抑制 How 选用Top10,基因特殊结构： Why 具有高AT、高GC、反向重复序列的基因，不容易连接 How 调整、摸索连接体系和条件尝试不同的载体，不同的骨架对片段偏好性不同,PCR鉴定重组子失败： 现象：用通用引物鉴定时，扩增产物既无目的带又无载体自连带 How 预变性95 10min（彻底裂解菌体、释放DNA）最好能用通用引物鉴定,菌落多为淡蓝色或FishEye： Why 插入片段没有影响LacZ基因读码框插入片段小（小于400bp） How
7、不要丢弃平板！进行进一步鉴定,基因定点突变技术,利用PCR实现点突变的几种传统方法 GeneTailor，QuickChange，Easy /Fast Mutagenesis System三种市售点突变试剂盒的比较,传统方法：仅利用PCR,反向PCR定点突变 重叠延伸PCR定点突变 大引物PCR定点突变,反向PCR： 特点： 必须以质粒为模板； 引物方向相反； 引物需要磷酸化。,重叠延伸PCR： 特点：两轮PCR,大引物PCR： 特点：两轮PCR,GeneTailor，QuickChange，Easy/Fast Mutagenesis System也是基于PCR原理实现点突变，但它们与传统方法
8、的区别主要在于可以对突变克隆进行初步的筛选 筛选原理：降解甲基化质粒模板 筛选依据：来自大肠杆菌的质粒99%发生甲基化；PCR是去甲基化过程，PCR产物（发生突变的产物）是去甲基化的产物。,筛选方法： 体内降解：原始质粒模板可以被能降解甲基化质粒的大肠杆菌（DMT）降解，而去甲基化的扩增产物（发生突变的产物）不会被降解。 体外降解：DpnI识别序列5-GmATC-3（在DNA序列中，一般每256bp中出现一次）。甲基化模板可被DpnI识别、切割，而去甲基化的扩增产物（发生突变的产物）不会被降解。,Invitrogen： GeneTailor Mutagenesis System,优点 引物部分
9、重叠，指数扩增 扩增产物可见，易于操作 筛选方法：DMT体内降解缺点： 突变点在一条引物上 无DpnI限制性内切酶降解模板,Stratagene： QuickChange Mutagenesis System,优点： 筛选方法：DpnI限制性内切酶缺点： 引物完全重叠，线性扩增，扩增产物不可见，可操作性差 扩增产物为线状 无DMT体内消化降解模板,TransGen: Easy/Fast Mutagenesis System,共有部分：PCR组分、DpnI酶、DMT细胞 Easy Mutagenesis System：使用EasyPfu酶 Fast Mutagenesis System：使用FastPfu酶扩增速度比Taq更快、保真性比Pfu更高，扩增10Kb左右的质粒只需2个小时！（请参考金品是怎样炼成的）,TransGen：,引物部分重叠，指数扩增，扩增产物可见，易于操作；扩增产物为环状； 两条引物上均有突变点，突变效率高； DpnI体外降解筛选 + DMT体内降解筛选=双重筛选！大大提高阳性率。,TransGen：Easy/Fast Mutagenesis System引物设计示意图,谢 谢 ！,精益求精，服务科研 TransGen就在您身边！,
