1、 RNA 甲基化 m6A 调节果蝇性别分化和神经功能 | 案例解析 标题： m6A modulates neuronal functions and sex determination in Drosophila m6A 调节果蝇性别分化和神经功能 发表时间： 2016 年 12 月 发表期刊： Nature IF： 40.1 机构：德国美因茨大学 1、 前言 RNA 修饰在表观转录调控中十分重要，其中 m6A 修饰在许多哺乳动物中广泛存在。许多真核生物中都存在 m6A 修饰，包括人、小鼠、斑马鱼甚至酵母。许多研究表明大量的m6A 修饰落在了 RRACH motif（ R, purine; H
2、, non-guanine base）内，另外终止密码子和 3 UTR 区域也有大量的 m6A 修饰。 RNA 甲基化修饰参与许多转录后调控 ， 包括 mRNA前体剪切 ， mRNA 降解和翻译，其中的“ reader”酶 YTH 家族起到十分重要的作用。 RNA甲基化转移酶（ methyltransferase）能够催化腺苷酸 N6 位发生甲基化，包括 METTL3、METTL14、 WTAP、 Vir 等。而去甲基化酶包括 FTO 和 ALKBH5。 已知在小鼠胚胎干细胞中将 METTL3 敲除（ knockout）后能够阻止其发生分化，MELLT3 基因功能缺失对小鼠胚胎干细胞的发育具有
3、致死做用。同样在果蝇中， METTL3 的同源蛋白 Ime4 被敲除后也具有亚致死作用，由于 NOTCH 信号通路受损从而影响果蝇的生育能力。在模式植物拟南芥中， METTL3 同源蛋白 Ath-MTA 被敲除后，其发育也会受到很大影响。另外， Ime4 基因对酵母的减数分 裂也有很重要的作用 。 种种迹象表明 ， m6A 修饰对生物早期性器官发育以及早期的胚胎发育至关重要。 近几年的结构生物学研究表明 ，RNA 甲基化 METTL3 和 METTL14 会形成杂络物行使催化作用，但是生物体内的作用机制至今仍然未知。参与 RNA 甲基化的酶包括： 类别 基因 功能 Writers METTL3
4、, METTL14, WTAP, KIAA1492 METTL3 和 METTL14 形成杂络物，在体内和体外催化RNA 发生 m6A 甲基化修饰。而 WTAP（ Fl(2)d）和KIAA1492（ Vir）以及其他 factors 也杂络物的 重要组成部分。这些 Writers 都有 consensus motif Erasers FTO, ALKBH5 以 及 其 他homologies 去甲基化酶 ， 介导 m6A 去甲基化修饰 Readers YTHDF1、 YTHDF2、 YTHDF3 以及其他同源家族蛋白 识别 RNA 甲基化修饰的信息，并参与下游 RNA 的翻译、降解等过程。这些
5、 YTHDF 家族的蛋白普遍都含有YTH domain 2.果蝇神经系统存在 较高的 m6A 修饰 昆虫整个生命周期包括胚胎 期、幼虫期（一龄幼虫三龄幼虫）、蛹期以及成虫期。作者先检测了野生型果蝇各个时期的 m6A 整体的甲基化水平，使用质谱法对 Ime4、 dMettl14和 fl(2)d 三种蛋白相对表达水平做了一个热图 。 从热图中我们可以发现在胚胎早期尤其是 2小时后 m6A 水平处于一个很高的水平，之后开始下降。在三龄幼虫期， m6A 水平开始上升 ，在蛹期又达到了一个高峰后逐渐下降。果蝇成虫期的头部以及卵巢中 m6A 水平也一直维持相对较高水平。 RNA 甲基化 系统进化树分析表明
6、，果蝇的 METTL3 同源蛋白 Ime4 有两种密切相关的蛋白 CG7818和 CG14906。在果蝇的 SR2+细胞（ embryonic-derived Schneider）中敲低 Ime4 和CG7818 后， m6A 水平下降 70%而敲低 CG14906 却没有任何影响。 由于 CG7818 与METTL14 结构上具有很大的保守性和相似性，作者将 CG7818 重新命名为 dMettl14。 同样 fl(2)d 和 Vir 基因与 WTAP 和 KIAA1429 高度同源 ， 敲低后对果蝇的 m6A 水平也会产生较大的影响。 在哺乳动物尤其是人体内中 ， RNA 甲基化转移酶 M
7、ETTL3 和 METTL14 会形成杂络物，而 WTAP 和 KIAA1429 也是重要的组成部分 。在果蝇甲基化转移酶中同时发现了 Vir、 fl(2)d和 Ime4。作者对果蝇的 fl(2)d 敲低后， Ime4 和 dMettl14 的 interaction 显著降低。 基因定位实验表明参与 m6A 甲基化的酶都位于细胞核内且都在胚胎早期发育阶段处于RNA 甲基化 高表达水平。另外胚胎晚期，这些酶在神经外胚层也有较高的转录水平。 3.YT521-B 介导 m6A 调控 mRNA 可变剪切 作者使用 MeRIP-seq， 从 812 个基因中鉴定了到了 1120 个 m6A 的 pea
8、k。其中 92%的 peak 都 含有 RRACH motif。此外，其他类型的序列或 motifs 也含有较高的 m6A 水平，这表明这些 motifs 可能也对甲基化转移酶具有特异性 。 此外 ， 与其他真核生物类似 ， 在果蝇体内 start codon 和 stop codon 区域存在很高的m6A 甲基化修饰。 接下来 ， 作者针对 SR2+细胞系中与 m6A 相关的各种酶敲低后进行了转录组测序，这些酶包括 Ime4、 CG6422、 dMellt14、 YT521-B 以及 Fl(2)d。从上图 a 中我们可以明显看RNA 甲基化 到， MA-plot 显示不同敲低条件 下， SR
9、2+细胞系中的基因表达发生了显著的差异（ p0.05）。图 b 表示不同敲除条件下三个生物学重复基因表达的 spearman 相关系数表。图 c 则是剪切模式的 spearman 相关系数表。 其中作者发现 Fl(2)d 敲低后效果最为明显，超过 2000 个基因表达显著差异。敲低 Ime4和 dMettl14 后，通过上面的韦恩图可以发现 SR2+中差异表达基因数量小于 Fl(2)d（ milder effects）。 GO 功能富集分析表明，这些差异表达的基因涉及各种功能如阴离子转运、细胞粘附等。尽管 SR2+细胞系并不是直接 起源于神经系统，但是许多差异基因都富集到了 neuronal
10、functions 上 ，如 axon guidance 和 synapse activity。 RNA 甲基化 通过表达量盒形图发现， 基因较低组的细胞中整体表达水平显著高于 control 组。接下来，对 SR2+细胞系中的 Ime4 和 dMettl14 这 2 个基因进行双敲低（ double knockdown）。韦恩图显示至少 15%的基因都有 m6A 的 peak。 Ime4 和 dMettl14 双敲后， m6A 甲基化水平仍然发生了轻微但是仍然显著的差异 。这个结果表明每个转录本可能 拥有独立的 m6A peak 位点。 RNA 甲基化 文章还发现在基因剪切事件上，双敲的结果
11、与 2 种酶单独敲的结果低还是存在显著差异的。 在任意一种酶的敲低实验中 ， fl(2)d 这个基因都行使十分重要的作用。通常情况下，不同酶敲低都会对基因 5 的剪切以及内含子保留等行为产生影响 ， 这种情况同样也存在于人细胞系中 。 YTH 家族蛋白是 一种十分重要的 reader 酶。果蝇中， CG6422 和 YT521-B 属于 YTH家族的同源蛋白 。蛋白细胞定位实验表明 CG6422 位于细胞质中，受精后在胚胎期 2 小时达到最大值，接下来持续下降并且在幼虫期和蛹期一直维持较低的水平。然而，蛋白细胞定位实验表明 YT521-B 位于细胞核中，并且在胚胎的神经系统已经成虫的大脑中处于
12、较高的转录水平。 RNA 甲基化 使用点印记法 （ dot-plot）和 pull down 实验表明， YT521-B 能够与 RNA 上的 m6A位点相结合。转录组测序表明，敲低 CG6422 后，差异基因 RNA 剪切事件几乎影响不大。但是敲低 YT521-B 后，转录组结果表明有 103 个基因的剪切事件差异显著。 韦恩图显示YT521-B 与 common target 以及 CG6422 交集不到 30%。所以这些证据都表明 YT521-B 在 pre-mRNA 剪切上行使极其重要的功能。 4.m6A 甲基转移酶对果蝇的行为调控 为了寻找 m6A 相关酶的潜在功能，作者分别构建了
13、Ime4 和 dMellt14 敲除的果蝇。 其中 针对 Ime4 这个基因使用两种方法敲除方法， Ime4Null（ CDS 全部敲除） 和RNA 甲基化 Ime4Cat（ C 端保留催化结构域）。文章发现无论是纯合果蝇还是发生杂合突变的果蝇，幼虫都能羽化存活至成年期。卵巢中没有发现任何 encapsulation defects。 但是突变型果蝇寿命变短 ，飞行和爬行受阻，无法合翅。尽管突变型果蝇能够勉强合翅伸缩翅膀，但是很难将翅膀合拢在腹部和胸部的背面。另外 dMettl14 基因突变型果蝇虽然翅发育正常 ， 但是行为能力却已经缺失 。 为了验证 Ime4 和 dMettl14 是否在果
14、蝇体内能够相互补偿，作者构建了双突变果蝇和单基因突变果蝇。结果表明，这 2 个基因功能相似调控的通路也相似 ，可能调控 common targets。此外， Ime4 似乎在功能上比 dMettl14 更占优势，大部分催化反应需要甲基化转移酶有特定的催化结构域。 小贴士 ： 果蝇属于昆虫纲双翅目，只有一对翅膀，另一对翅膀已经进化成平衡棒，用于辅助平衡飞行。通常翅膀会合拢在胸部和腹部的背面。 行为实验表明 Ime4 突变型果蝇爬行速度显著低于野生型果蝇，定向能力（ Orientation）也出现问题。种种证据表明 m6A 修饰通过调控神经系统，从而严重影响果蝇的行为。为了通过表型行为探究深层的神
15、经缺陷和分子机制，作者在 Ime4 突变型果蝇幼虫中进行了肌肉神经接头测试（ NMJ）。上图显示 NMJ 在 Ime4 突变型幼虫内树突生长是野生型的 1.5 倍。RNA 甲基化 结果表明 Ime4 通过控制 NMJ 的树突生长来调节果蝇幼虫的爬行行为。 为了鉴定 果蝇 行为的靶基因 ， 作者对二日龄雌果蝇成虫的头部进行了解剖并进行转录组测序 。 通过转录组结果分析 ， 作者在 Ime4 突变型中 鉴定了 1600 多个差异基因在基因剪切模式上发生改变。这些差异基因绝大部分都是控制果蝇行为的。接下来作者又对 SR2+细胞系原有的 MeRIP 数据与转录组 数据进行比对，发现大部分调控果蝇行为的
16、基因都发生了m6A 甲基化修饰。作者推测，甲基化转移酶缺陷的情况下，可能有不止一个基因调控果蝇的行为。 5.甲基化修饰 m6A 调控果蝇性别分化 在果蝇体内 ,sxl 基因这个开关激活与否由上游的剂量补偿效应来调控控制果蝇的性别分化，果蝇性别分化机制详见下面小贴士部分。文章内，作者通过实验发现 Ime4 对 Sxl 影响很大。 Sxl 基因在雄虫和雌虫中同时存在，只不过雄虫 Sxl 基因有一个额外插入的外显子。在突变体雄性果蝇基本不受 Ime4 的影响，而两种突变型雌性果蝇在基因型上都表现出 与雄性果蝇共有的外显子插入以及雌雄果蝇独有的剪切模式。无论是雌虫还是雄虫， Sxl 不同转RNA 甲基
17、化 录本下降水平不是特别明显，这表明 m6A 可能在大脑中特异性富集。 Sxl 基因下游调控的 2 个基因 tra 和 msl 也发生了显著变化。这表明甲基化转移酶可能会影响 Sxl 基因的 pre-mRNA 的剪切，从而影响果蝇性别分化和剂量补偿效应。为了验证这个猜想，作者使用 Ime4 杂合突变的雌虫与 Sxl 杂合突变的雄虫进行杂交，统计后代存活率发现后代雄虫不受影响， Ime4 与 Sxl 缺失的雌性大幅度下降。所以结果表明， Ime4 破坏了果蝇体内正常的 剂量补偿效应，并通过调控 Sxl 影响雌雄果蝇的存活。 小贴士 ： 果蝇 (左 )和家蝇 (右 )在控制性别分化上采用完全不同的
18、机制 。 2017 年 Science 刊登论文首次鉴定了家蝇雄性决定基因 Mdmd。果蝇通常采用补偿剂量机制（ dosage compensation），即当上游的 X:A 的常染色体和性染色体比例决定下游的 Sxl 是否会被激活。如果 Sxl 基因受到影响，无论上游的 X:A 染色体比例如何，果蝇都会发育成雄性成虫。RNA 甲基化 相反，如果 Sxl 一直处于激活状态，则果蝇会发育成雌性成虫。 6.YT521-B 缺失与 m6A 表型之间的关系 鉴于 YT521-B 能够特异性识别 m6A 甲基化位点，从而影响 SR2+细胞中 绝大部分由m6A 介导的 RNA 剪切事件，作者对 各种参与
19、RNA 甲基化的酶进行了敲除（ knockout）实验。 YT521-B 缺失能够引起不同转录本表达异常，而 YT521-B 突变果蝇虽然能够存活至成虫期，但是飞行等行为受到了很大的影响。 将 YT521-B 突变雌虫与 Ime4 突变雌虫进行转录组测序 ，发现各自有 243 和 397 个基因存在剪切模式的差异。 5 端可变剪切位点特异性不高 ， 内含子部分保留仍然较多 。显然，YT521-B 突变也能影响 male-specific Sxl，从而影响下游的 tra 和 msl-2，继而使得雌虫体内 female-specific Sxl 转录水平降低 。 以上结果表明 m6A 甲基转移酶是
20、通过 YT521-B调控果蝇行为和性别分化。 7.Nito 是一种全新的参与 m6A 修饰的酶 RNA 甲基化 为了探究 YT521-B 的调控机制，作者利用 SILAC 技术，对 SR2+细胞培养过程中的氨基酸进行同位素标记，结合质谱技术和免疫共沉淀对 SR2+细胞中和 YT521-B 免疫结合的蛋白进行定量分析。几 乎一半（ n=30）与预测的结合蛋白相符合。为了验证其中是否存在m6A 介导的剪切事件，我们分别对这 30 个蛋白进行了 depleted，然后评估 fl(2)d 对剪切事件的影响。其中蛋白 Hrb27C、 Qkr58E-1 和 Nito 与 fl(2)d 控制的剪切现象相符合
21、。 分析了 6 个额外的 m6A 介导的剪切事件表明， Hrb27C 和 Qkr58E-1 仅仅调控一个蛋白亚基 ， 而 Nito 的缺失会导致基因剪切时间异常 ， 这个异常现象与 YT521-B 及其蛋白复合物功能缺失后的现象比较相似。 接下来作者使用免疫共沉淀将 YT521-B 与 Hrb27C、 Qkr58E-1 和 Nito 三种结合蛋白进行共沉淀探寻蛋白间的相互作用。结果表明， Hrb27C 和 Qkr58E-1 与 YT521-B 的结合依赖于 RNA。 RNA 甲基化 而 Nito 蛋白与 YT521-B 蛋白相结合则完全不依赖于 RNA。但是 Nito 蛋白与 Ime4 以及 fl(2)d 相结合依赖于 RNA。 Nito 基因的敲低会导致 m6A 修饰水平的降低。因此 Nito 缺失对于 m6A 的水平影响很大。该研究还鉴定到了果蝇 m6A 甲基转移酶复合体中的新亚基Nito(Spenito)。
