1、R NA 干扰（RNA interference，RNAi）是几近年发现的基因表达调节新机制，双链 RNA（dou-ble-strandeRNA，dsRNA） 以调节子的身份降解目的 mRNA，从而调节目的基因的表达.这一发现使人们重新认识了 RNA 在基因信息流控制过程中的重要性.RNAi 已成为基因功能研究中倍受青睐的基因敲下工具，而且它正促使新一轮基因组范围内基因功能研究运动的蓬勃开展.1 RNA 干涉的分子机制1.1 RNA 干涉的起始阶段在这一阶段中，进入细胞的长的 dsRNA 被加工成约 22nt 的双链小干扰 RNA （small interfer-enceRNAs，siRNAs
2、），它们具有 5 磷酸 、3 羟基末端以及两个游离核苷酸突出，在 RNAi 调控途径中起着十分关键的作用.这一加工过程由进化上十分保守的 Dicer 酶完成.其作用模式为：以细菌 RNA 酶为参照，它以二聚体形式参加反应，当反向平行排列的 RNA 酶基序和底物 dsRNA 结合后，能产生 4 个底物催化活性位点，但中间两个位点酶活性丧失，两端活性位点催化底物间距约 2nt. 因此，Dicer 结构有微弱变化即导致切割间距的改变，表现为 siRNA 长度的种属特异性.有研究表明，在线虫中，RNAi 的起始阶段需要 Dcr-l 、Rde-1 、以及Rde-4 的共同参与.1.2 RNA 干涉的效应
3、阶段RISC 是一个蛋白质 -RNA 效应核酸酶复合物，能够识别并降解目的 mRNA. 被 ATP 激活后，RISC 使与之结合的 siRNA 解旋 、解链，并在其指导下通过碱基配对定位到同源 mRNA 上，并在距离siRNA 3 端 12 个碱基的位置切割 mRNA. 切割后的 mRNA 由于没有 5 帽结构和 Poly(A)核酸酶降解mRNA 尾巴的保护，很快被其它的核酸酶降解.RISC 发挥作用还需要其它蛋白质因子的参与.研究表明，具 PAZ/PiWi 结构域的 Argonaute 蛋白可能参与 PTGS/RNAi.在线虫中，Rde-1 、Rde-4 、以及Ppw-1 是 RNAi 所必
4、需的.1.3 沉默信号的传递与放大在线虫中发现，使用微量的 dsRNA，RNAi 的沉默信号即可遍及整个机体，且可以传递给下一代，在植物中也有类似现象.研究表明，在线虫或拟南芥中，细胞内一种 RNA 依赖的 RNA 聚合酶（RdRP） 能够以 Dicer 酶生成的 siRNA 为引物，以RNA 干涉技术在基因功能研究中的应用与展望梁 雪（浙江大学 生命科学学院，浙江 杭州 310053）摘 要： RNA 干涉是由双链 RNA 诱导的基因沉默现象，具有高特异性 、高效性等优势，因而作为一种反向遗传技术广泛地应用于基因功能的研究.本文就近年来 RNA 干涉技术在基因功能研究中的应用作一综述 .关键
5、词： RNA 干涉；反向遗传学方法；基因功能中图分类号： Q786 文献标识码： A 文章编号 ：1673-260X（2008）06A-0013-03Vol. 24 No. 6Nov. 2008第 24 卷 第 6 期2008 年 11 月赤 峰 学 院 学 报（ 自 然 科 学 版）Journal of Chifeng University（Natural Science Edition）图 1 RNAi 的分子机制核酸酶降解 mRNAsiRNADicer以 siRNA 为引物 RdRP 催化合成新的双链 RNA靶序识别RdRPmRNA活化的 siRNA 蛋白复合体，RISC特异性蛋白结合，
6、siRNA 解链双链 RNA双链 siRNADlcerRdRP 催化外源双链RNA 病毒双链RNA 其他双链RNA 一场单链RNA13 靶 mRNA 为模板延伸生成 dsRNA，再经 Dicer 酶切割，反复循环构成 siRNA 的信号放大.2 RNA 干涉基因功能研究中的优势随着越来越多的物种基因组测序的完成，解析基因组中基因功能 、基因的表达调控及基因之间的关系网络逐渐成为今后很长一段时期的任务.传统的基因功能的研究方法有定向克隆及转基因技术等正向遗传学方法，以及基因敲除 、反义技术及核酶技术等反向遗传学方法等.然而，定向克隆和基因敲除周期长 、成本和技术要求高，反义技术及核酶技术的抑制基
7、因表达效率低，这些都影响了它们在基因功能研究中的应用.作为一种新的反向遗传学方法，RNAi 具有许多优点，使其渐渐成为基因功能研究的强大武器.2.1 高特异性siRNA 与靶基因的结合是严格遵守碱基互补配对原则的，即使是一个碱基的错配，也将大大减弱 RNAi 的作用.而且，只有针对编码区的 dsRNA才能产生 RNAi，而针对内含子或启动子区域 dsR-NA 不能产生 RNAi.2.2 高效率RNAi 对基因表达的抑制率可以达到 90%以上，能快速获得与基因敲除相近的缺失突变表型.另外，由于在线虫和植物中存在沉默信号的传递与放大，因此，仅需要低剂量的 dsRNA 即可实现强烈的抑制.2.3 高
8、穿透性dsRNA 分子能够通过细胞膜 、细胞间隙和细胞屏障而被转运，从而在不同细胞甚至生物体间可长距离传递和维持，甚至可通过生殖系统传递到后代中去.2.4 操作灵活RNAi 既可以实现在一个个体或一个细胞内同时沉默多个基因，也可以实现在个体发育的不同阶段沉默基因表达，在需要时又恢复基因的功能.2.5 简便易行，成本较低人工合成 、体外转录 、表达载体等产生 dsRNA的方法技术要求不高.而且，除了人工合成的方法外，相对于基因克隆及基因敲除，产生 dsRNA 的成本较低.2.6 适合于针对全基因组基因建立 siRNA 或其表达库3 RNA 干涉在基因功能研究中的应用3.1 RNA 干涉在单个或小
9、规模基因功能研究中的应用将 RNAi 技术用于将某个基因 “敲下 ”（knock-down） 或沉默来研究其在特定生物学过程中所起的作用. 这种方法已经成功地用于各种生物体 、各种组织细胞的基因功能研究，包括各种植物 、低等 、高等动物.LE 等通过在水稻中过量表达 OsMADSS0，发现开花提前；用 RNAi 技术沉默该基因，不仅开花延迟，而且茎秆结间增长，因此推测此基因在控制开花相关调控时可能起重要作用.Isa 等构建带有与有齿食道口线虫雄虫特异的 Od-mpp1 基因同源的 dsRNA 的质粒转入大肠埃希氏菌 HT15 中，饲喂给秀丽新杆线虫，发现虫体后代产量明显减少，表明被抑制的编码丝
10、氨酸 /苏氨酸蛋白磷酸酶的靶基因在虫体繁殖中发挥了作用.说明有齿食道口线虫和秀丽新杆线虫中编码丝氨酸 / 苏氨酸磷酸酶的基因在一定程度上同源.Ding 等应用 RNAi 技术抑制人脐静脉血管内皮细胞 profihn-1 基因表达后，发现肌动蛋白纤维和黏着斑的形成 、细胞与之间的黏附显著减少，膜突出功能丧失，并且抑制了细胞的生长.由此作者得出结论，profihn-1 对于内皮的增殖 、迁移和形态发生是很重要的.3.2 RNA 干涉在大规模基因功能研究中的应用2000 年，Fraser 等构建针对线虫第 1 号染色体2416 个基因的 dsRNA 细菌表达文库（基因覆盖率达 87.3%），给线虫喂
11、食细菌，诱导 RNAi 而获得基因功能缺陷表型，共鉴定出 339 个与生长发育及生殖表型有关的基因，生物信息学分析发现这些基因涉及物质和能量代谢 、细胞周期 、细胞结构 、信号转导等.Gonczy 等 17 用体外转录合成针对线虫第 3号染色体 2232 个基因的 dsRNA （基因覆盖率达96%），性腺注射，借助延时微分干涉相差显微摄影技术动态观察胚胎细胞分裂过程，发现 133 个基因与此有关.2003 年，Kamath 等用与 Fraser 同样的方法研究了线虫 16757 个基因（占线虫全基因组基因总数的 86%）的 RNAi 表型，共鉴定出 1722 个基因缺陷表型，其中 2/3 为首
12、次发现. 这是第一次用RNAi 技术大规模高通量的进行全基因组基因的功能的研究.之后，Ashrafi 等用 Kamath 等建立的 dsRNA 细菌表达文库筛选与脂肪储存有关的基因，发现 41714 个 基因与脂肪储存有关，其中有许多脂肪代谢调节基因与哺乳动物中的同源.Lee 等利用 Kamath 等建立的 dsRNA 细菌表达文库诱导 RNAi，筛选第 1 和第 2 号染色体上共 5690 个基因与寿命有关的基因，发现约 15%与寿命相关的基因是线粒体的功能基因.dsRNA 表达文库在线虫中的成功应用，对于其他生物体功能基因组的研究具有很好的借鉴作用.3.3 RNAi 技术与基因芯片技术的结
13、合应用基因芯片技术能够高通量地检测在特定条件下细胞所有基因的表达情况，因此，把 RNAi 与基因芯片技术结合起来，能够了解细胞内所有基因及其表达产物之间的相互关系，从而更全面 、系统地解析基因的功能. 先用 RNAi 技术在特定条件下下调或关闭某一基因的表达，然后利用基因芯片技术在全基因组范围内检测每次 RNAi 后所有基因的表达情况，以此了解被沉默基因与其他基因的关系.然后再沉默另一个基因，不断重复这样的工作，直至完成对全基因组所有基因的检测分析，总结出基因之问的网络关系.Mousses 等建立了将 RNAi 与基因芯片技术有机结合在一起的 RNAi 微阵列技术. 将 siRNA- 脂质体复
14、合物点在玻璃片上制备成微阵列，将细胞铺在玻璃片上进行反向转染，然后整合化学发光 、显色 、放射活性检测等技术对 RNAi 结果进行分析.由于在一张玻璃片上有成千上万不同的 siRNA 点，因此能够高通量地研究基因功能.4 RNA 干涉在基因功能研究中的问题与展望虽然 RNA 干涉在基因功能的研究中有很大的优势，但仍存在一些问题.比如，在哺乳动物和人类细胞中，dsRNA 或 siRNA 产生的 RNAi 会衰减而不能产生放大效应；大于 30bp 的 dsRNA 导入哺乳动物细胞会诱导干扰素的合成，导致非特异性地和全面地抑制基因表达，最终导致细胞凋亡；dsRNA 诱发的 RNAi 效应的强度随其浓
15、度的增高而增强，但浓度过高时 RNAi 效应也会降低；蛋白质的功能是在与其他组分（蛋白质 、核酸 、小分子化合物等）相互作用中体现出来的，特定的表型可能是某一蛋白质中的某一功能域的结果，而 RNAi 还无法特异地沉默某个功能域.此外，RNAi 在各物种中的复杂的调控机制，许多涉及 RNAi 机制的新基因 、蛋白及其功能仍未鉴定或机理尚不明确，靶基因的突变妨碍 siRNA 对目标 RNA 的识别从而影响 RNAi 的效果等等，这些问题尚未解决，有待研究和探索.然而，这些问题的存在并没有影响 RNA 干涉技术在基因功能研究中的应用.RNA 干涉技术在单个基因 、小规模的基因功能研究，以及某些模式生
16、物中的大规模基因功能研究中取得的成果是非常显著的，对于基因功能的解析速度也是过去所无法比拟的. 可以预见，RNA 干涉技术将不仅以小规模或单基因的操作模式对基因功能进行研究，更将在真核生物基因组水平大规模高通量地研究基因功能.线虫中 dsRNA 表达文库的成功建立，将会拉开其他生物体功能基因组的研究序幕. 而且，随着RNAi 微阵列技术的进一步成熟和推广，人们能够高通量的筛选药物靶基因，检测人类基因组的表达抑制情况以明确基因的功能. 在后基因组时代中，RNA 干涉技术将发挥更为重要的作用.参考文献 ：1李建霞 ，等 .RNA 干扰技术及其应用 .中国农学通报 ，2006，22（12）.2Cry
17、stallographic and Modeling Studies ofRNase III Suggest a Mechanism for Double-Stranded RNA Cleavage. Blaszczyk J， TropeaJE，Bubunenko M， et a1JStructure (Camb)，2001，9(12)：1225-12363Heritable gene silencing in Drosophila usingdouble-stranded RNA. KennerdeB JR，CarthewRWJNat Biotechnol，2000，18(8)：896-89815
