1、分子生物学实验,苏州科技学院化学与生物工程学院,实验一,植物基因组DNA的提取,一、实验目的,通过本实验学习从植物中提取DNA的方法。,利用液氮对植物组织进行研磨，破碎组织与细胞。细胞提取液中的SDS溶解膜蛋白破坏细胞膜，蛋白质变性沉淀。EDTA抑制DNA酶的活性。利用酚、氯仿抽提去除杂蛋白。冷乙醇沉淀DNA。冰浴或65水浴有利于抑制DNA酶的活性。,二、实验原理,1、仪器：低温离心机，恒温水浴器，琼脂糖电泳系统，凝胶成像分析系统。2、试剂：细胞提取液，酚/氯仿，乙醇，TE等,三、仪器与试剂,四、实验步骤,1.取1g新鲜幼嫩植物叶片,2.液氮中研磨成粉，转移至1.5ml EP管中,3.加入裂解
2、液600ul，酚60ul，氯仿600ul,4.轻轻混匀，置于65水浴20min,5.12000rpm，15min,6.取上清，加入等体积酚/氯仿，混匀,7.12000rpm，5min,实验流程,水相，酚相,蛋白质,有机相,8.取上层水相，加两倍体积的冷乙醇，1/10体积NaAc,9.冰浴静置约20min,10.12000rpm，5min,11.弃去上清，取沉淀，用70%乙醇洗三次,12.稍干燥，用50ul TE溶解（65）,13.上样电泳,琼脂糖凝胶电泳,14. EB 染色,注意：EB具有强致癌性,15.凝胶成像观测实验结果,注意事项,操作时，动作尽量轻柔，避免机械剪切力引起的DNA断裂。操作
3、过程中注意防护，避免受到伤害，包括液氮、酚、氯仿、EB等化学药品。,实验二,植物基因组总RNA的提取,一、实验目的,通过本实验学习从植物中提取总RNA的方法。,利用液氮对植物组织进行研磨，破碎组织与细胞。利用异硫氰酸胍作为强变性剂，破坏内源性RNase、多糖、蛋白质。利用DEPC抑制外源RNase活性。利用酚、氯仿抽提去除杂蛋白。异丙醇沉淀RNA。冰浴或65水浴有利于抑制DNA酶的活性。,二、实验原理,1、仪器：低温离心机，恒温水浴器，琼脂糖电泳系统，凝胶成像分析系统。2、试剂：异硫氰酸胍，DEPC，酚/氯仿，异丙醇，TE等,三、仪器与试剂,四、实验步骤,1.取1g新鲜幼嫩植物叶片,2.液氮中
4、研磨成粉，转移至1.5ml EP管中,3.加入变性液600ul，NaAc 60ul，混匀,4.加入600ul酚/氯仿/异戊醇，震荡，冰浴15min,5.4，12000rpm，10min,6.取上清，加入等体积异丙醇，混匀，-20，30min,7.4，12000rpm，10min,实验流程,水相，酚相,蛋白质,有机相,8.弃上清，沉淀稍干燥，重新溶于200ul变性液（中途可在65热激10s）,9.加入20ulNaAc混匀， 冰浴静置约20min,10.加入600ul酚/氯仿/异戊醇，震荡，冰浴15min。12000rpm，20min,11.上层水相加入1/10体积NaAc，二倍体积异丙醇混匀，-
5、20，1hr,12.12000rpm，20min,15.上样电泳,13.弃去上清，取沉淀，用70%乙醇洗三次,14.稍干燥，用50ul DEPC水溶解,琼脂糖凝胶电泳,16. EB 染色,注意：EB具有强致癌性,15.凝胶成像观测实验结果,注意事项,本次试验重要的是防止内源性和外源性RNase酶对RNA的降解作用。注意带好口罩、手套等防护设备。操作过程中注意防护，避免受到伤害，包括液氮、酚、氯仿、EB等化学药品。,实验三,PCR扩增,一、实验目的,通过本实验学习从用PCR的方法扩增目的基因。,实验四,SDS-PAGE测定蛋白质的分子量,一、实验目的,通过本实验学习SDS-PAGE测定蛋白质的分
6、子量。,二、实验原理,电泳的一般原理,带电粒子在电场作用下，朝向与其本身所带电荷相反的方向泳动的现象。,制胶原理,胶的浓度取决于Acr和Bis的浓度,In general, use a 5% gel for good resolution in 50-200 kDa range, 10% for 15-75 and 15% for 10-35. Gradient gels (4-15 or 20%),制胶流程,分离原理,一、四个不连续性1. pH不连续2. 缓冲液离子成分不连续 凝胶孔径不连续 电势不连续,分离原理,二、三种物理效应 浓缩效应 分子筛效应 电荷效应,SDS的作用,1、仪器：低温
7、离心机，恒温水浴器，琼脂糖电泳系统，凝胶成像分析系统。2、试剂：上游引物、下游引物、Taq酶、dNTP、模板等,三、仪器与试剂,四、实验步骤,制胶,样品制备及处理,电泳,SDS-PAGE电泳仪,琼脂糖凝胶电泳,考马斯亮蓝染色,凝胶成像观测实验结果,注意事项,丙烯酰胺在聚合之前有神经毒性，聚合之后毒性消失。过硫酸铵需当天配制。注意带好口罩、手套等防护设备。,聚合酶链式反应（PCR）的原理类似于天然复制过程。在待扩增的DNA片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA特异性扩增2n倍。,二、实验原理,1、仪器：低温离心机，恒温水浴器，琼脂糖电泳系统，凝胶成像分析系统。2、试剂：上游引物、下游引物、Taq酶、dNTP、模板等,三、仪器与试剂,四、实验步骤,1.反应体系（50ul）模板 3ul上游 1ul下游 1ul10xbuffer（Mg2+） 5uldNTP 4ulTaq酶（3U/ul） 0.5ulddH2O 36.5ul,反应体系,2.反应程序94 5min94 30s56 30s72 1min72 10min,反应程序,32 cycles,PCR扩增仪,琼脂糖凝胶电泳,EB 染色,注意：EB具有强致癌性,凝胶成像观测实验结果,注意事项,本次试验由于很多剂量都只有微升级，所以一定要对移液器的正确操作。注意带好口罩、手套等防护设备。,
