1、纤溶酶的研究进展李慧慧 20090801118（徐州工程学院食品（生物）工程学院， 徐州 江苏 221000,China）摘要： 溶栓疗法是血栓性疾病安全有效的治疗手段, 开发安全高效、廉价的新型纤溶酶对于预防与治疗血栓性疾病具有重要意义。目前, 利用微生物发酵产生的纤溶酶制成新型的溶栓药物已成为研究热点。本文综述微生物发酵生产纤溶酶的研究背景、现状、意义及主要方向 。 关键词：微生物，纤溶酶，药理作用Fibrinolytic enzyme researchLi Huihui 20,090,801,118(Xuzhou Engineering Food (Biological) Enginee
2、ring, Xuzhou, Jiangsu 221 000, China)Abstract: Thrombolytic therapy of thrombotic diseases is safe and effective treatment, the development of safe and efficient, cheap new plasminogen has important significance for the prevention and treatment of thrombotic diseases. At present, the plasminogen use
3、 of microbial fermentation to produce a new thrombolytic agents has become a hot topic. This paper reviews the microbial fibrinolytic enzyme produced by the research background, current status, significance, and the main direction.Keywords: microorganisms, plasminogen, and pharmacological effects血栓栓
4、塞性疾病是一类严重危害人类健康的心血管疾病 1, 发病率呈上升趋势。目前治疗血栓栓塞性疾病的最为有效并且可靠的手段是采用纤维蛋白溶解酶或激活剂进行的溶栓疗法。溶栓药物或通过激活纤维蛋白溶解酶原转化成纤维蛋白溶解酶, 后者催化血栓的主要基质纤维蛋白水解, 使血栓溶解, 血管再通达到溶栓的目的 ; 或者直接溶解血栓中的纤维蛋白 , 使血栓溶解。第一代 溶栓剂链激酶( SK)和尿激酶 ( UK)缺乏纤维蛋白选择性, 不仅能激活血栓表面的纤溶酶原,也能激活血浆中游离的纤溶酶原, 使得纤维蛋白原降解, 会产生全身性出血的副作用。而且 SK 具有免疫原性会产生过敏反应。第二代溶栓剂组织型纤溶酶原激活剂(
5、tPA)和尿激酶原( proUK)等较第一代溶栓剂对纤维蛋白亲和有所提高, 但半衰期短、用药剂量大、价格昂贵, 且口服仍会引起内出血的副作用目前, 国际上正致力于开发第三代溶栓剂, 如用蛋白质工程手段对 tPA 进行改造 , 通过对某些定点突变或是通过相关结构域的删除、增加或融合等手段以提高其对纤维蛋白的选择性、提高对纤溶酶原激活剂抑制剂的抗性、延长其在血液循环中的半寿期以及发展导向性溶栓功能。早期研究和发现的链激酶与葡激酶, 已通过临床试验用于血栓性疾病 ,其效果稳定可靠; 前期深入研究的芽孢杆菌及链霉菌来源的纤溶酶, 其理化性质与酶学活性都已被研究清楚, 其中多种纤溶酶已被尝试用于制备新型
6、溶栓药; 近期发现的粪链球菌、海洋假单胞菌、白色假丝酵母菌、镰孢菌、米曲霉菌、藤黄微球菌、黄绿蜜环菌等等, 所产生的纤溶酶也为新型溶栓药的开发提供了更多的可用之材。从不同微生物中提取和纯化的纤溶酶, 其理化性质和生物学活性均存在一定差异。笔者着重就这些方面的研究进展作一综述。 1 产酶菌种的筛选与研究微生物是溶栓药物的重要来源,现已成功筛选到许多产生纤溶活性物质的菌株, 如芽孢杆菌（Bacillussp.) CK11- 4 等均能产生纤溶酶。1.1 从传统发酵食品中分离产纤溶酶菌种纳豆是日本的传统大豆发酵食品。研究者发现, 这些发酵食品具有产纤溶活性物质的微生物, 它们主要是芽孢杆菌类微生物,
7、 而纳豆正是由枯草杆菌(Bacillus subtilis)或纳豆杆菌(Bacillus natto)发酵大豆制成的。1987 年, 日本学者 Sumi2等首先在纳豆中发现和提取出具有溶解血栓功能的活性物质, 并定名为纳豆激酶( Nattokinase, NK)，通过纳豆激酶的动物体内血栓实验以及健康人群的体内溶栓实验研究表明, 纳豆激酶除了具有显著的溶栓作用之外, 还具有溶解纤溶酶原激活剂抑制物的作用, 从而促进静脉内皮细胞产生纤溶酶原激活剂, 保证了纤溶酶原激活剂的生理活性 3豆豉是我国传统大豆发酵食品,在中医药学上是一味中药。李江伟等 4首次从豆豉中筛选到产纤溶酶的菌株并分离出豆豉纤溶酶
8、,分离获得的纤溶酶经 SDS-PAGE 测定分子量为 36kDa, 这种纤溶酶可以直接溶解纤维蛋白和人凝血块。之后,又有学者相继报道了豆豉中存在一种溶解纤维蛋白的酶,此酶具有很好的抗凝、溶栓作用,故命名为豆豉纤溶酶( DEF ) 5,也有人称溶栓酶、豆豉激酶。 董明盛6等人从豆豉等材料中分离到产纤溶酶的菌种 NK-5,经确定与纳豆菌同为芽抱杆菌属枯草杆菌群,在营养琼脂平板上菌落灰白色,表面粗糙有皱折,边缘规 则,无光泽 ,不透明,在肉汤中生长不混浊,表面形成菌膜,厌氧不生长,为革兰氏阳性菌,根据产酶特性初步认定为纳豆杆菌群。韩润林 7等人从一种豆豉中分离得到一株枯草杆菌(HL-986), 有较
9、高的纤溶酶活性,分子量为 27kDa。值得一提的是,豆豉纤溶酶产生菌并非一种,来源不同的菌种在特性上有一定差异,有的菌种可以认为与纳豆杆菌同属一个菌群,变异较小,但有的则不能认为是同一菌群。豆豉纤溶酶产生菌并非一种,来源不同的菌种在特性上有一定差异,有的菌种可以认为与纳豆杆菌同属一个菌群,变异较小,但有的则不能认为是同一菌群。1.2 从真菌中分离出的纤溶酶1.2.1 根酶发酵物中分离出纤溶酶根酶 12#纤溶酶的分子量是目前已知纤溶酶中最低的，仅有 18KD。 杜连祥等 8用华根霉(Rhizopuschiensis)12 与去皮的大豆和面粉以一定比例发酵的方法提出纤溶酶。根霉纤溶酶仅作用于枯草杆
10、菌蛋白酶和胰蛋白酶的底物, 而不作用于凝血酶、尿激酶和胰蛋白酶的特异性合成底物, 底物专一性好。能降解纤维蛋白原 、 链, 还可激活血纤维蛋白溶酶原成纤溶酶,从而间接降解纤维蛋白。根霉纤溶酶 N 端氨基酸序列与其它生物来源的纤溶酶氨基酸序列比较, 没有同源性。采用凝胶层析和 SDS-PAGE 法测定纤溶酶分子量分别为 16. 6kDa 和 18. 0kDa, 因此认为是一种单亚基的纤溶酶。根霉纤溶酶分子量小, 较大分子量的蛋白质更能抵抗胃肠道中酸碱和酶的降解, 因此适合开发成口服类溶栓剂。 1.2.2 黄绿蜜环菌发酵物中分离出纤溶酶目前，对于真菌类蜜环菌 产纤溶酶的报道很少。徐德钦等 9以微生
11、物产纤溶酶为指标，以真菌为试验菌种，从实验室保藏的 30 余株菌种中筛选到 1 株产胞外溶纤酶较高的菌种 黄绿蜜环菌 U-11, 并对培养基的碳源氮源豆汁加入与否培养基 PH，离子及其浓度为指标，对该菌株进行发酵产纤溶酶优化。研究结果表明，以麸皮为碳源，酵母膏为氮源，加入 0.1MgSO 2，用豆汁配制培养基，PH4.0 时 均可得到单因素试验条件下的最大产酶效果。 1.2.3 蛹虫草菌丝发酵产生的纤溶酶蛹虫草 10内含有虫草素、虫草酸、多糖、腺苷等多种有效成分，其食用及药用价值可与天然冬虫夏草相媲美 11。蛹虫草（Cordyceps militaries）纤溶酶分子量也较高，为 52KD。宿
12、红艳 12等采用盐析、透析和离子交换层析获得了蛹虫草纤溶酶粗酶样品，并对其酶学性质进行了初步研究。蛹虫草纤溶酶的最适作用温度为 37，最适作用 pH 值为 8.0，与正常人体内部血液的生理条件相近有利于以蛹虫草为原料开发人体保健营养品和溶纤药物产品。在此条件下具有最高活性。该实验也证实蛹虫草纤溶酶是一种金属蛋白酶，金属离子 Ca2+、Fe 2+在低浓度 (0.01mmol/L)时蛹虫草纤溶酶酶活较高。1.2.4 平菇深层培养产纤溶酶 沈明花 13发现平菇菌丝体产纤溶酶，通过乙醇沉淀, CM-cellulose 阳离子交换层析，DEAE-sephadex A-50 阴离子交换层析，Sephade
13、x G-75 凝胶层析及 Superdex75 凝胶层析等步骤将之分离纯化。钱朋智等 14平菇液体发酵产纤溶酶的条件进行了优化，以平菇为产纤溶酶菌种，采用单因素实验，确定该菌株产纤溶酶的最适发酵培养基为：葡萄糖 2，豆浆15，KH 2PO40.3，Mg 2SO40.15最适培养条件为：初始 PH 为自然，接种量为直径 1cm 的菌片1 片，培养基装 80mL 液量 ，培养温度 25，摇床转速 150r/min ，发酵周期 6d 。在此条件下，发酵液纤溶酶活力（相当于尿激酶活力单位) 稳定达到 5.20IU/mL。1.2.5 白灵侧耳纤溶酶 白灵侧耳 15 Pleurotus nebrodens
14、is (Inzenga) Qul.，俗名白灵菇，属于真菌门 Eumycota。白灵侧耳具有防治老年人心血管疾病、妇科肿痛、儿童佝偻病及防癌抗癌等药用功效 16。白灵侧耳子实体浸提液经过硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow 阴离子交换层析、凝胶过滤层析和羟基磷灰石色谱柱层析后，纯化得到一种纤溶酶 17。该酶在 SDS-PAGE 中显单条带，其分子量约为 30kDa 。该酶在 45以下，pH6.510.0 的范围内稳定，最适 pH 为 8.0，最适温度为 25。金属离子 K+对该酶有明显的激活作用，Zn+、 Mg2+、Cu2+对酶有部分抑制作用。金属离子鳌合剂 EDTA 和
15、丝氨酸蛋白酶抑制剂 PMSF 不抑制该酶活性，初步说明此酶既不是金属酶，也不是丝氨酸类蛋白酶。该酶既具有纤溶酶作用，又具有激活纤溶酶原的作用。此外, 已有从白色假丝酵母菌 18、 米曲霉菌 19、藤黄微球菌 20、密环菌发 21酵物中分离出纤溶酶的报道。 2 微生物纤溶酶的药理作用和应用前景微生物纤溶酶有两类不同的作用机制：一类是通过激活纤维蛋白溶酶原成为纤溶酶间接降解纤维蛋白，如链激酶 葡激酶和 BK等，为纤溶酶原激活剂；另一类则可直接降解纤维蛋白溶解血栓 这一类纤溶酶的种类较多，有 SW-1DFE QK TPase 以及 Jeot-Gal 酶等有的纤溶酶兼具直接降解和激活纤溶酶原的双重作用
16、，CK 根霉 12#纤溶酶和 Bacillus.spnov.SK006 等纤溶酶属于此类型。另外，还有些纤溶酶有 2 种以上的作用方式，如纳豆激酶有直接降解纤维蛋白 激活尿激酶原刺激组织型纤溶酶原激活剂 tPA 的产生降解和失活纤溶酶原激活剂 tPA 的抑制剂 PAI-1 四种；TPase 在直接溶解纤维蛋白的同时也能够降解 PAI-1 使其失活从而发挥作用 22。从溶栓效能来看，TPase 可能成为目前最有前景的溶栓药物之一。Kim 23等比较了 TPaseNK以及 IMR-NK1 对枯草杆菌蛋白酶底物（N-SucAla-Ala-Pro-Phe-pNA）作用的动力学参数，发现TPase 催化
17、底物的效率是 NK 的三倍。由于 TPase 也同为枯草杆菌蛋白酶和丝氨酸蛋白酶，该底物特异性也反映其具有极强的溶解纤维蛋白能力。目前我们提及的这些纤溶酶中，有较多动物及体内实验结果的仅为纳豆激酶（NK）研究发现其溶栓活性在血液中能维持 3 小时以上 24。Sumi 25等人给肺血栓模型鼠口服纳豆菌粉（natto Bacillus） ，在 50mg/Kg 剂量下鼠的肺血栓数量减少，血清中优球蛋白溶解时间（ELT）有缩短的趋势，健康人口服 100mg/Kg 剂量 1-4 小时后 tPA 活性增强，ELT 也明显缩短 26，说明服用纳豆菌粉也有利于溶栓作用的加强此外，枯草激酶 CK 目前也已在动物
18、实验中表现出比较理想的溶栓效果除溶栓外，一些纤溶酶也发现具有其他的药理作用如海洋假单胞菌碱性蛋白酶 MPAP 能明显抑制血小板的聚集，对于抑制血栓的形成十分有利 27；Ace02 对龋齿的主要致病菌变异链球菌 Streptoccus mutans 有溶菌活性 28；myulchi 激酶有抑制肿瘤的作用，在6g/mL 浓度条件下即能杀伤肿瘤细胞 K562 和 YAC-1，效果分别达到 35和 70，而对人正常胸腺上皮细胞 MCF 10A 活力没有影响 29。纳豆激酶还具有诱导玻璃体后脱离的作用，在治疗眼部疾病方面也可能发挥作用 30；同时,H su 等研究发现，纳豆激酶也能够降解淀粉样纤维 31
19、 ，有在预防和治疗老年痴呆症 Alzheimers diease）方面发挥作用的潜力。动物试验结果和口服给药方式研究显示纳豆激酶是一种有潜力的纤溶酶，纳豆激酶的片剂冲剂胶囊口服液及针剂已有研究并形成专利 32，市场上也有纳豆胶囊纳豆激酶肠溶胶囊纳豆激酶素等保健品销售，但纳豆激酶在人体中的使用效果安全性等数据依然相当有限或缺乏，其他微生物纤溶酶在溶栓作用专一性体外体内药理实验及临床试验等方面更亟待进一步的研究。1 桂清. 血栓性疾病已成为威胁人类健康和生命的重要疾病 J. 中华检验医学杂志, 2004, 8( 27): 487.2 SmiH,HamadaH,TsushimaH,eta.lAnov
20、el fibrinolyticenzyme( nattokinase)in thevegetable cheese natto, a typical and popular soybean food in the Japanese diet. Experienti3 马子川,张英锋,范林. 溶栓新药 纳豆激酶 J. 化学世界, 2009( 2): 126-1284 李江伟 , 冉国侠 , 陈新梅. 豆豉纤溶酶的分离纯化及其体外溶栓作用. 中国生化药物杂志, 1999, 3: 148-1505 阎家麒 , 童岩, 减莹安. 豉纤溶酶的纯化及其性质研究 J . 药物生物技术, 2000, 7 (
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