犬瘟热病毒一步RT_PCR检测方法的建立_张洪亮.pdf

1、欀欀欀欀欀欀欀欀欀欀欀欀欀欀欀欀欀欀欀欀氈氈氈氈兽 医科 技犬瘟热病毒一步 RT-PCR 检测方法的建立张洪亮1， 孟培培1， 宋晓明2， 杨瑞梅1，秦晓冰1， 丰艳妮1， 黄 娟1*， 单 虎1*( 1 青岛农业大学动物科技学院 ， 山东 青岛 266109;2 乳山市畜牧局 ， 山东 乳山 264500)摘要 : 根据犬瘟热病毒 ( CDV) 弱毒株 Onderstepoort 的核蛋白 ( N) 基因的相对保守区序列设计了 1 对特异性寡聚核苷酸引物 ， 在国内首次建立了 CDV 一步 RT-PCR 检测方法 。该法可以特异地扩增出 N 基因 265 bp 大小的目的片段 ， 可以检测到

2、 0. 043 6 g/mL 的总 RNA， 与两步法 RT-PCR的敏感性相当 。对 25 例犬瘟热临床疑似病例样品 ， 一步法 RT-PCR 检测出 17 份阳性 ， 与两步法 RT-PCR 的阳性符合率达 94. 4%， 胶体金检测试纸条检测出 13 份阳性 。研究结果表明 ， 建立的 CDV 一步法 RT-PCR 检测方便 、敏感 、特异 ， 适用于 CDV 临床病料的检测和分子流行病学调查 。关键词 : 犬瘟热病毒 ; 一步 RT-PCR; 检测中图分类号 : S852. 65 文献标识码 : A 文章编号 : 0529-5130( 2012) 01-0049-04犬瘟热病毒 ( c

3、anine distemper virus， CDV) 是引起犬 科 、鼬鼠科及部分浣熊科多种动物犬瘟热( Canine distemper， CD) 的病原 13。反转录 -聚合酶链式反应 ( RT-PCR) 诊断方法由于具有较高的敏感性和特异性 ， 因而广泛应用于临床样品中 CDV 的检测 48。目前 ， 在 RNA 病毒检测中 ， 两步法 RT-PCR应用的较多 ， 但未见国内有关一步法 RT-PCR 用于检测 CDV 的报道 。为此 ， 本研究针对 CDV N 蛋白的相对保守区序列设计了 1 对特异的寡聚核苷酸引物 ， 建立了 CDV 一步 RT-PCR 检测方法 ， 并利用该方法检测

4、了来自山东不同地区的水貂 、狐狸 、貉和犬的疑似犬瘟热病料 。1 材料与方法1. 1 毒株 、细胞和病料CDV Lederle 株 、犬细小病毒 ( CPV) 由本实验室保存 ; Vero、BHK-21 细胞由山东信得药业有限公司惠赠 ; 狂犬病活疫苗由齐鲁动物保健品有限公司生产 ; 鸡新城疫低毒力活疫苗 ( Clone-30 株 ) 由青岛易邦生物工程有限公司生产 ; 病料来自山东青岛 、潍坊 、威海等地区毛皮动物养殖场和动物医院送检的疑似犬瘟热病例 ， 其中水貂 15 例 、狐狸 2 例 、貉 3 例 、犬 5 例 ， 无菌采集脑 、肝 、肺 、脾以及膀胱等脏器 。收稿日期 : 2011-

5、05-10; 修回日期 : 2011-10-28基金项目 : 山东省自然科学基金 ( ZR2010CL023) 。作者简介 : 张洪亮 ( 1984- ) ， 男 ， 硕士研究生 。* 通讯作者 : 黄娟 ， 博士 ， 副教授 ， 主要从事动物传染病分子诊断与防治研究 ， E-mail: happyhj888 163. com; 单虎 ， 博士 ， 教授 ，主要从事动物传染病防治和生物制品研究 ， E-mail: shanhu67163. com。1. 2 主要试剂DMEM 培养基购自美国 Gibco 公司 ; 标准胎牛血清购自天津灏洋生物制品科技有限公司 ; TaKaRa Ri-bonucl

6、ease Inhibitor、 dNTP、 Reverse Transcriptase( AMV) 、rTaq DNA 聚 合 酶 、DNA 分 子 量 标 准DL2000 购自大连宝生物工程公司 ; Trizol 试剂购自Invitrogen 公司 ; 琼脂糖购自上海夏夷实业有限公司 ;DEPC 购自 Sigma 公司 。1. 3 病毒培养待培养 Vero 细胞长满单层 ， 将培养液弃去 ， 用不含血清的 DMEM 冲洗 3 次后 ， 置于超净台上备用 。将冻干病毒以 1 mL PBS 液溶解 。将溶解的病毒用无菌吸管接种细胞 ， 37 感作 1 h。弃去细胞瓶内液体 ， 用无菌 PBS 液

7、洗涤 3 次 ， 加 1%双抗和不含血清的 DMEM 培养基 10 mL， 6 h 后换液 1 次 。72 h 后 ，待细胞出现明显病变后以封口胶封口 ， 将细胞反复冻融 3 次 。10 000 r/min， 离心 10 min， 取上清 20 保存备用 。1. 4 引物的设计与合成利用 DNAstar 软件中的 MegLign 比对 GenBank 中登录的不同来源的 18 株 CDV 的全基因序列 ， 同时BLAST 比对 GenBank 上发表的所有 CDV N 蛋白基因序列 ， 选定 N 基因的相对保守区 。根据 GenBank 中CDV Onderstepoort 株的基因序列 ，

8、利用 primer 5. 0 设计了 1 对特异性寡聚核苷酸引物 ， 扩增目的片段大小为 265 bp。P1: 5-CTCTGCTTGCGGTCTTAC-3; P2:5-AATCCACCTTCTCATCTCC-3。引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成 。1. 5 病毒总 RNA 的制备采用 Invitrogen 公司的 Trizol 试剂提取 RNA。主要步骤为 : ( 1) 取 250 L 处理好的病毒悬液加入到94畜牧与兽医 2012 年 第 44 卷 第 1 期EP 管中 ， 再加入 750 L Trizol LS Reagent， 颠倒混匀后于 4 静置 5 min; ( 2) 加入

9、200 L 氯仿 ， 反复颠倒 EP 管振荡 5 6 次至乳化均匀 ， 4 静置约 10min; ( 3) 4 、12 000 r/min 离心 15 min， 取出 EP管 ， 轻轻吸取上层水相约 500 L 转移入另一新 EP管 ; ( 4) 加入等体积 ( 500 L) 的冰冷异丙醇( 20 保存 ) ， 颠倒混匀后置 20 过夜 ( 或70 放置 30 min) ， 充分沉淀核酸 ; ( 5) 4 、12 000 r/min 离心 10 min， 弃上清液 ， 加入 1 mL75% 乙醇 ( 4 保存 ) ; ( 6) 4 、12 000 r/min 离心5 min， 弃去上清液 ，

10、倒置 EP 管干燥核酸 ( 放置时间不宜超过 25 min) ， 加入 20 L DEPC H2O 溶解 RNA。1. 6 反应体系及扩增条件1. 6. 1 一步法 RT-PCR反应总体积为 25 L， 其中模板 RNA 3 L， 5Reverse Transcriptase Buffer 5 L， 2. 5 mmol/L dNTP2. 5 L， RNase inhibitor 0. 5 L， AMV 反转录酶 0. 5L， P1、P2 各 0. 5 L， rTaq DNA 聚合酶 0. 5 L，去离子水 12 L。优化一步法 RT-PCR 循环参数 ， 确定最佳的反应程序为 : 42 60

11、min; 95 5 min;94 30 s， 50. 8 40 s， 72 1 min， 30 个循环 ;72 延伸 10 min。反应结束后取 6 L 产物进行1. 2%琼脂糖凝胶电泳 ， 利用凝胶成像系统拍照并分析结果 。1. 6. 2 两步法 RT-PCR反转 录 体 系 为 20 L， 其 中 RNA 5 L， 5 Reverse Transcriptase Buffer 4 L， 2. 5 mmol/L dNTP 2L， RNase inhibitor 0. 5 L， AMV 反转录酶 0. 5 L，P1、P2 各 0. 5 L， DEPC H2O 7 L。42 反转录 1h， 之后

12、 70 10 min 灭活反转录酶 。PCR 体系为 25L， 其中上述反转录产物 2 L， 10PCR buffer 2. 5L， 2. 5 mmol/L dNTP 2 L， P1、P2 引物各 0. 5 L，rTaq DNA 聚合酶 0. 5 L， ddH2O 17 L。反应程序为 : 95 5 min; 94 30 s， 50. 8 40 s， 72 1min， 30 个循环 ; 72 延伸 10 min。反应结束后取 6L 产物进行 1. 2% 琼脂糖凝胶电泳 ， 利用凝胶成像系统拍照并分析结果 。1. 7 特异性检测提取狂 犬 病 毒 ( RV) 疫 苗 株 、新 城 疫 病 毒(

13、NDV) 疫苗株 、CDV Lederle 株和正常 Vero、BHK-21 细胞的 RNA 及 CPV 的 DNA。取核酸模板各 3 L，以 P1、P2 为引物 ， 优化的循环参数下进行 PCR 扩增 ， 琼脂糖电泳鉴定结果 。1. 8 敏感性试验将 CDV Lederle 株 Vero 细胞培养物及上清处理 ，提取 RNA， 进行 101108系列稀释 ， 利用紫外分光光度计测定核酸浓度 ， 按优化的循环参数进行一步法RT-PCR 扩增 ， 电泳观察 ， 确定反应的敏感性 。1. 9 重复性试验以建立的一步法 RT-PCR， 分别对 CDV Lederle株 、送检的犬瘟热阳性病料以及 C

14、DV 细胞培养物和正常细胞对照样品重复检测 3 次 ， 以验证试验的稳定性 。1. 10 临床病料检测无菌取山东青岛 、潍坊 、威海等地区送检的疑似犬瘟热的水貂 、狐狸 、貉和犬的脑 、肝 、肺 、脾以及膀胱等脏器 ， Trizol 法提取 RNA， 进行一步法 RT-PCR 鉴定 。2 结果2. 1 反应条件优化通过反复多次对不同条件的摸索 ， 优化了一步法RT-PCR 的反应体系 。以引物 P1/P2 在 48 58 退火温度范围内分别扩增 CDV Lederle 株 ， 在 49. 7 54. 0 时出现明显的特异性目的条带 ， 以 50. 8 扩增时 ， 目的条带最佳 ， 故选用 50

15、. 8 作为最适退火温度 ( 见图 1， 2) 。05 Animal Husbandry Veterinary Medicine 2012 Vol. 44 No. 12. 2 特异性试验按上述反应体系 ， 采用一步法 RT-PCR 扩增 CDVLederle 株 ， 得到了 265 bp 的特异片段 ， 而从 RV、NDV、CPV 和正常 Vero、BHK-21 细胞中均未扩增出条带 。2. 3 敏感性试验10 倍系列稀释提取的 CDV Lederle 株的核酸 ， 采用两步法 RT-PCR 扩增 ， 106稀释模板能扩增到 265bp 的目的条带 ， 而采用建立的一步法 RT-PCR 法在同

16、样条件下扩增 ， 稀释度达 106亦出现明显的 265 bp的目的条带 ( 见图 3) 。通过紫外分光光度计测定 ，检测出的最低核酸浓度为 0. 043 6 g/mL。M DNA 标准 DL2000; 1-6: 分别为 101-106CDV 病毒 RNA 模板稀释液的 RT-PCR 产物图 3 RT-PCR 敏感性试验 ( 上图一步法 ， 下图两步法 )2. 4 重复性试验利用建立的一步法 RT-PCR 方法在不同时间对每份样品重复检验 3 次 ， 检验结果一致 。2. 5 临床病料的检测分别用一步法 RT-PCR 和两步法 RT-PCR 检测了25 份送检的临床犬瘟热疑似病例的脏器组织样品

17、，各检测出阳性样品 17 份和 18 份 ， 检出率分别为68%、72%， 阳性符合率为 94. 4%。见表 1。表 1 一步法和两步法 RT-PCR 对临床样品的检测两步法 RT-PCR一步法 RT-PCR阳性 阴性 合计阳性 17 1 18阴性 0 7 7合计 17 8 253 讨论CDV 为有囊膜 、非重叠的单股负链 RNA 病毒 ，大小约为 15 690 nt。病毒的主要结构蛋白有核蛋白( N) 、磷 蛋 白 ( P) 、大 蛋 白 ( L) 、基 质 膜 蛋 白( M) 、融合蛋白 ( F) 、血凝蛋白 ( H) ， 其中 N 蛋白是麻疹病毒属中主要的交叉抗原 ， 是保守性较强的免疫

18、原性蛋白 911。本研究针对 N 蛋白的相对保守区设计了 1 对特异性引物 ， 优化反应条件和程序 ， 建立了 CDV 一步 RT-PCR 检测方法 。以副黏病毒科的NDV 及 RV、CPV 两种犬科动物易感染的病毒进行特异性检测 ， 未见非特异性扩增 ; 最小核酸检测量约为0. 043 6 g/mL， 结果表明建立的犬瘟热一步 RT-PCR检测方法具有较强的特异性和敏感性 。并初步利用该方法对临床疑似犬瘟热病料进行了检测 ， 说明该方法适用于毛皮动物和犬的犬瘟热诊断 。两步法 RT-PCR 中 ， cDNA 合成和 PCR 反应是 2个独立的酶催化反应 ， 其反应所需要的底物和反应条件都是不

19、同的 ， 加入的试剂较多 ， 耗时较长 ， 成本较高 12。一步法 RT-PCR 的 cDNA 合成和 PCR 反应都在同一个管中完成 ， 5 RT Buffer 中含有 10 PCRBuffer 的组成 ， 而前者特有的 DTT ( 二硫苏糖醇 ) 不会影响 PCR 反应 ， 虽然各组成在浓度上有一定差异 ，但进行短片段的 PCR 扩增是可行的 。与两步法相比 ，一步法 RT-PCR 节省了加样时间 ， 避免了两步法中取样的污染 ， 并且节省了试剂的用量 ， 尤其适用于大批量样品的检测 。但在临床样品检测中发现 ， 可能由于样品中的病毒核酸浓度过低 ， 一步法 RT-PCR 存在个别样品假阴

20、性的情况 ， 说明其敏感性较两步法 RT-PCR 略低 ， 这与陈阳婷等 12的报道相符 。今后可在现有的基础上改进犬瘟热一步法 RT-PCR， 进一步提高反应的灵敏度 ， 使其更好地应用于生产实践 。参考文献 : 1 侯加法 小动物疾病学 M 北京 : 中国农业出版社 ， 2002:82-84 2 Roelke-Parker M， Munson L， Packer C， et al A canine distempervirus epidemic in Serengeti lions ( Pantheraleo) J Nature，1996， 379: 441-445 3 陈溥言 兽医传染病

21、学 M 北京 : 中国农业出版社 ， 2006:415-416 4 Frisk A L， Konig M， Moritz A， et al Detection of canine distempervirus nucleoprotein RNA by reverse transcription-PCR using serum，whole blood， and cerebrospinal fluid from dogs with distemper J J Clin Microbiol， 1999， 37( 11) : 3634-3643 5 Elia G， Decaro N， Martella

22、 V， et al Detection of canine distempervirus in dogs by real-time RT-PCR J J Virol Methods， 2006，136( 1-2) : 171-17615畜牧与兽医 2012 年 第 44 卷 第 1 期群禽腺病毒分离鉴定及 hexon 基因的序列分析罗思思 ， 谢芝勋*， 邓显文 ， 刘加波 ， 庞耀珊 ，谢志勤 ， 谢丽基 ， 彭 宜 ， 范 晴( 广西兽医研究所 /广西畜禽疫苗新技术重点实验室 ， 广西 南宁 530001)摘要 : 为调查禽腺病毒的感染状况 ， 20082010 年从广西南宁市活禽市场采集

23、样品 259 份 ， 通过 SPF 鸡胚传代增殖 ， 经 PCR 鉴定 ， 92 份为禽腺病毒阳性 ， 阳性率为 35. 5% ( 92/259) 。选取不同年份的 8 株进行免疫琼脂扩散 、血凝性 、致细胞病变 、形态学和鸡胚致病性试验 。结果 : 8 株均与 群禽腺病毒阳性血清反应 ， 不能凝集鸡红细胞 ， 病毒粒子具有腺病毒典型特征 ， 可致鸡胚肝细胞变圆 、折光性增强 ， 使鸡胚发育不良 。将克隆的 8 株 hexon 基因进行序列比对及遗传进化分析 ， 显示均与 群禽腺病毒同源性最高 ， 亲缘关系最近 。结果表明 ， 8 株分离株均为 群禽腺病毒 。关键词 : 群禽腺病毒 ; 分离

24、; 鉴定 ; hexon中图分类号 : S852. 659 文献标识码 : A 文章编号 : 0529-5130( 2012) 01-0052-05禽腺病毒 ( fowl adenovirus， FAV) 归于腺病毒科禽腺病毒属 ， 群禽腺病毒为线状双链 DNA 病毒 1， 具有共同的群抗原 ， 共 12 个血清型 ( FAV1FAV12) ， 代表株为鸡胚致死孤儿病毒 ( CELOV) 2。群 、群禽腺病毒代表株分别为火鸡出血性肠炎病毒 ( HEV) 和减蛋综合征病毒 ( EDSV) 。群禽腺病毒包括传统的禽腺病毒及其他禽类分离物 ， 普遍存在于鸡 、鸭 、鹅体内 ， 呈隐性感染 ， 与其他

25、病原共同作用于家禽 ， 既可水平传播 ， 也可垂直传递 ， 污染鸡胚 3。该病较多地在体内复制而不发病 ， 但已有研究发现某些毒株具有致病性 46， 如1976 年暴发的包涵体肝炎 ; 1987 年报道了心包积液综合征在肉鸡中的危害 ; 1993 年报道了砂囊糜烂由收稿日期 : 2011-06-14; 修回日期 : 2011-10-28基金项目 : 广西特聘专家专项经费资助项目 ( 2011B020) ; 国家百千 万 人 才 工 程 人 选 专 项 资 金 ( 945200603 ) ; 广 西 科 技 攻 关( 0815009-3-6) ; 广西自然科学基金 ( 2010GXNSFA013

26、090) 。作者简介 : 罗思思 ( 1985- ) ， 女 ， 硕士 。* 通讯作者 : 谢芝勋 ， 研究员 ， 主要从事分子免疫学与病毒学的研究 ， E-mail: xiezhixun126. com。群禽腺病毒引起 ， 并作为屠宰场必检的病原之一 。此外 ， 群禽腺病毒还可引起轻度呼吸道症状 、产蛋下降和胰腺萎缩 、坏死等 。为了调查 群禽腺病毒在健康鸡群中的感染状况 ， 本试验进行了系统的病原分离鉴定 ， 为该病的防控提供参考依据 。六邻体 ( hexon) 是 群禽腺病毒的主要结构蛋白 ， 在病毒粒子二十面体结构中含量最高 ， 含有 240个壳粒 ， 而 群禽腺病毒毒粒共 252 个

27、壳粒 ， hexon占了 90%以上 。六邻体具有型 、群和亚群特异抗原决定簇 ， 是中和抗体的靶目标 ， 因此 ， 依据编码该蛋白基因建立起来的 PCR 诊断方法可用于该群血清型的鉴定 。本研究从 20082010 年广西南宁市活禽市场健康鸡群中 ， 采集肛拭子样品 259 份 ， 经 SPF 鸡胚传代增殖与 PCR 鉴定 ， 从中选取不同年份的 8 株进行免疫琼脂扩散 、血凝性 、细胞病变 、形态学和鸡胚致病性试验研究 ， 以及克隆 hexon 基因 ， 进行序列和遗传进化分析 ， 确定 8 株分离株为 群禽腺病毒 ， 分别命名为 GX/01/2008、GX/02/2008、GX/01/2

28、009、GX/02/2009、 GX/03/2009、 GX/01/2010、 GX/02/2010 和 GX/03/2010櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔。 6 鞠会艳 ， 夏咸柱 ， 高玉伟 ， 等 用 RT-PCR 检测病料中犬瘟热病毒 的 研 究 J 吉林农业大学学报 ， 2006， 128 ( 13) :317-320 7 王凤雪 ， 闫喜军 ， 柴秀丽 ， 等 犬瘟热病毒 RT-nested PCR 检测方法的建立与应用 J 中国兽医科学 ， 2007， 37( 11) :955-959 8 邢明伟 ， 曾祥伟 ，

29、柴洪亮 ， 等 SYBR Green 荧光 RT-PCR 法快速检测毛皮动物源犬瘟热病毒 J 中国兽医学报 ， 2010， 30( 5) : 57-61 9 罗 彬 ， 易 立 ， 王建科 ， 等 犬瘟热病毒核衣壳蛋白分子生物学研究进展 J 特产研究 ， 2010( 2) : 70-73 10 Veronika von M， Christoph S， Patricia D， et al A Ferret Model ofCanine Distemper Virus Virulence and Immunosuppression J Journal of Virology， 2003， 77:

30、12579-12591 11 Gaedke K， Zurbriggen A， Baumgartner W， et al In vivo and invitro detection of canine distemper virus nucleoprotein gene with dig-oxigenin-labelled RNA， double-stranded DNA probes and oligonu-cleotides by in situ hybridization J Zentralbl Veterinarmed B，1997， 44( 6) : 329-340 12 陈阳婷 ， 宁 红 ， 张 敏 一步法 RT-PCR 和两步法 RT-PCR对马铃薯病毒诊断研究的比较 J 中国农学通报 ， 2010， 26( 11) : 298-30225 Animal Husbandry Veterinary Medicine 2012 Vol. 44 No. 1