1、细胞工程,邢朝斌科技楼0510Tel:3726238E-mail:,Cell Engineering,细胞工程邢朝斌,第四章 植物组织器官培养技术,第一节 植物脱毒及快速繁殖技术,第二节 花药及小孢子培养,第三节 植物胚胎培养,第四节 植物的离体受精,第五节 组织培养常见问题及对策,第四章 植物组织器官培养技术,概念：胚胎培养是指使胚或具胚器官在离体无菌条件下发育成幼苗的技术。类型：包括胚培养、胚乳培养、胚珠培养、子房培养。,第三节 植物胚胎培养,细胞工程邢朝斌,第四章 植物组织器官培养技术,胚胎培养的意义和类型A 克服远缘杂交的不育性，获稀有杂种B 打破种子休眠，缩短育种年限。主要有以下两种
2、：（1）使种胚发育不全的植物获得后代。（2）使含抑制性物质不发芽的种胚发芽。,第三节 植物胚胎培养,细胞工程邢朝斌,第四章 植物组织器官培养技术,胚胎培养的意义和类型C 使生活力低下或无生活力的种子萌发D 使柑橘类植物合子胚正常发育E 获三倍体或单倍体植株F 快速繁殖特殊植物G 用于基础研究,第三节 植物胚胎培养,细胞工程邢朝斌,第四章 植物组织器官培养技术,一、植物胚培养(embryo culture of plants)（一）、胚培养的概念与类型 概念：在无菌条件下将胚从胚珠或种子中分离出来，置于培养基上进行离体培养的方法,第三节 植物胚胎培养,细胞工程邢朝斌,第四章 植物组织器官培养技术
3、,一、植物胚培养1成熟胚培养,第三节 植物胚胎培养,细胞工程邢朝斌,第四章 植物组织器官培养技术,一、植物胚培养2幼胚培养 幼胚是指子叶期以前的幼小胚,第三节 植物胚胎培养,细胞工程邢朝斌,第四章 植物组织器官培养技术,一、植物胚培养2幼胚培养(1) 幼胚培养的关键技术：取材球形胚至鱼雷形胚,第三节 植物胚胎培养,细胞工程邢朝斌,第四章 植物组织器官培养技术,一、植物胚培养2幼胚培养(1) 幼胚培养的关键技术：幼胚剥离保湿迅速培养条件的控制,第三节 植物胚胎培养,细胞工程邢朝斌,第四章 植物组织器官培养技术,一、植物胚培养2幼胚培养（2）幼胚离体培养的生长发育方式胚性发育： 幼胚接种到培养基上
4、以后，仍然按照在活体内的发育方式发育，最后形成成熟胚，然后再按种子萌发途径出苗形成完整植株。,第三节 植物胚胎培养,细胞工程邢朝斌,第四章 植物组织器官培养技术,一、植物胚培养2幼胚培养（2）幼胚离体培养的生长发育方式早熟萌发： 幼胚接种后，在培养基上迅速萌发成幼苗。有时会形成许多胚状体，从而形成许多植株，这种现象称为丛生胚现象。,第三节 植物胚胎培养,细胞工程邢朝斌,第四章 植物组织器官培养技术,一、植物胚培养2幼胚培养（2）幼胚离体培养的生长发育方式愈伤组织： 一般来讲由胚形成的愈伤组织大多为胚性愈伤组织，这种胚性愈伤组织很容易分化形成植株。,第三节 植物胚胎培养,细胞工程邢朝斌,第四章
5、植物组织器官培养技术,一、植物胚培养2幼胚培养（3）离体幼胚培养的影响因素培养基 培养基类型 渗透压,第三节 植物胚胎培养,细胞工程邢朝斌,第四章 植物组织器官培养技术,一、植物胚培养2幼胚培养（3）离体幼胚培养的影响因素附加物： a、氨基酸类 b、维生素类 c、天然提取物 d、生长调节剂,第三节 植物胚胎培养,细胞工程邢朝斌,第四章 植物组织器官培养技术,一、植物胚培养2幼胚培养（3）离体幼胚培养的影响因素环境条件 初期弱光和黑暗 温度为该植物种子萌发的适宜温度,第三节 植物胚胎培养,细胞工程邢朝斌,第四章 植物组织器官培养技术,一、植物胚培养2幼胚培养（3）离体幼胚培养的影响因素培养材料
6、基因型和胚发育程度胚的发育阶段,第三节 植物胚胎培养,细胞工程邢朝斌,第四章 植物组织器官培养技术,二、子房培养授粉前子房培养授粉后的子房培养,第三节 植物胚胎培养,细胞工程邢朝斌,第四章 植物组织器官培养技术,二、子房培养1材料的选择 （1）品种间的差异（2）胚囊发育时期：八核胚囊和成熟胚囊期的子房,第三节 植物胚胎培养,细胞工程邢朝斌,第四章 植物组织器官培养技术,二、子房培养2培养基（1）基本培养基（2）植物生长调节物质（3）蔗糖浓度3.接种方式 极性 营养吸收,第三节 植物胚胎培养,细胞工程邢朝斌,第四章 植物组织器官培养技术,三、被子植物胚乳培养1概况A、胚乳细胞的全能性。B、能否通
7、过胚乳培养获得三倍体；C、研究胚和胚乳的关系。,第三节 植物胚胎培养,细胞工程邢朝斌,第四章 植物组织器官培养技术,三、被子植物胚乳培养2植物胚乳的发育特性植物胚乳可以分为两大类：被子植物胚乳是双受精的产物。裸子植物胚乳在受精前就已形成。,第三节 植物胚胎培养,细胞工程邢朝斌,第四章 植物组织器官培养技术,三、被子植物胚乳培养3影响胚乳培养的因素（1）胚乳的发育时期： 旺盛生长期为最佳时期。（2）基因型（3）培养条件（4）胚因子,第三节 植物胚胎培养,细胞工程邢朝斌,第四章 植物组织器官培养技术,三、被子植物胚乳培养4胚乳培养的形态发生愈伤组织形成 直接进行器官分化,第三节 植物胚胎培养,细胞
8、工程邢朝斌,第四章 植物组织器官培养技术,一、离体受精的概念和意义 从花粉萌发到受精形成种子，从种子萌发到幼苗形成的整个过程，均在试管内完成，称为离体受精，或试管受精。 克服自交不亲和性和远缘杂交障碍 为外源特异基因的有性转移，诱导遗传变异开辟了一条新途径。,第四节 植物的离体受精,细胞工程邢朝斌,第四章 植物组织器官培养技术,二、离体受精的方法（一）收集花粉参照花粉培养（二）剥取子房或胚珠 做母本的花蕾在开花前数天去雄并套袋,第四节 植物的离体受精,细胞工程邢朝斌,第四章 植物组织器官培养技术,二、离体受精的方法（三）离体受精的方法1、子房试管受粉直接引入法 注射法,第四节 植物的离体受精,
9、细胞工程邢朝斌,第四章 植物组织器官培养技术,二、离体受精的方法（三）离体受精的方法2、胚珠试管受粉哺育法 柱头接近法,第四节 植物的离体受精,细胞工程邢朝斌,第四章 植物组织器官培养技术,三、离体受精成功的技术关键1、离体胚珠的成活力和受精力 2、花粉萌发和花粉管的生长速度3、亲本组织的影响,第四节 植物的离体受精,细胞工程邢朝斌,第四章 植物组织器官培养技术,一、污染及控制1、污染的含义：指在组培过程中培养瓶内滋生菌斑，使培养材料不能正常生长发育，从而导致培养失败的现象。,第五节 组织培养常见问题及对策,细胞工程邢朝斌,第四章 植物组织器官培养技术,一、污染及控制2、污染原因（1）细菌污染
10、：菌斑呈黏粘液状，界限比较明显，一般接种后12天即能发现。主要是大肠杆菌和链球菌。,第五节 组织培养常见问题及对策,细胞工程邢朝斌,第四章 植物组织器官培养技术,一、污染及控制2、污染原因（2）真菌污染：菌斑呈绒毛状，界限不明显，伴有不同颜色的孢子接种后3-10天才能发现。主要是霉菌污染。,第五节 组织培养常见问题及对策,细胞工程邢朝斌,第四章 植物组织器官培养技术,一、污染及控制3、污染途径：（1）外植体带菌（2）培养基及接种器具灭菌不彻底（3）接种操作时带入（4）环境不清洁,第五节 组织培养常见问题及对策,细胞工程邢朝斌,第四章 植物组织器官培养技术,一、污染及控制4、污染的预防措施：A、
11、 防止外植体带菌（1） 选择好外植体采集时期和采集部位 （2）室内或无菌条件下进行预培养。（3）外植体严格灭菌 灭菌效果实验 多次灭菌和交替灭菌,第五节 组织培养常见问题及对策,细胞工程邢朝斌,第四章 植物组织器官培养技术,一、污染及控制4、污染的预防措施：B、保证培养基及接种器具彻底灭菌1 分装时培养基勿粘瓶口2 检查封口膜是否破损3 扎瓶口要位置适当，松紧适宜4 保证灭菌时间和高压锅内温度5 接种工具用前彻底灭菌6 工作服等布质品定期进行湿热灭菌,第五节 组织培养常见问题及对策,细胞工程邢朝斌,第四章 植物组织器官培养技术,一、污染及控制4、污染的预防措施： C、操作人员严格遵守无菌操作规
12、程 D、 保证接种与培养环境清洁（1） 污染瓶经高压灭菌后再清洗（2）定期熏蒸消毒、紫外灯照射（3）定期清洗或更换超净台初过滤器（4）定期对培养室消毒，防止高温,第五节 组织培养常见问题及对策,细胞工程邢朝斌,第四章 植物组织器官培养技术,二、培养物的不良表现及改进措施 （一）、初始培养阶段1、培养物水浸状、变色、坏死可能原因：杀菌剂过量，时间过长，外植体不当。改进措施：调换其他杀菌剂或降低浓度，缩短消毒时间，试用其他部位，生长初期取材。,第五节 组织培养常见问题及对策,细胞工程邢朝斌,第四章 植物组织器官培养技术,二、培养物的不良表现及改进措施 （一）、初始培养阶段2.培养物长期培养几乎无反
13、应可能原因：培养基不适，生长素不当，温度不适。改进措施：更换基本培养基，增加生长素用量。,第五节 组织培养常见问题及对策,细胞工程邢朝斌,第四章 植物组织器官培养技术,二、培养物的不良表现及改进措施 （一）、初始培养阶段3.愈伤组织生长过旺、疏松，后期水浸状可能原因：激素过量，温度偏高，无机盐含量不当。改进措施：减少激素，降低温度，调整无机盐（尤其是铵盐）含量，增加培养基硬度。,第五节 组织培养常见问题及对策,细胞工程邢朝斌,第四章 植物组织器官培养技术,二、培养物的不良表现及改进措施 （一）、初始培养阶段4.愈伤组织太紧密、平滑或突起，粗厚，生长缓慢可能原因：细胞分裂素用量过多，糖浓度过高，
14、生长素过量。改进措施：减少细胞分裂素用量，调整细胞分裂素与生长素比例，降低糖浓度。,第五节 组织培养常见问题及对策,细胞工程邢朝斌,第四章 植物组织器官培养技术,二、培养物的不良表现及改进措施 （一）、初始培养阶段5.侧芽不萌发,皮层过于膨大,皮孔长出愈伤组织可能原因：枝条过嫩，生长素、细胞分裂素用量过多。改进措施：减少激素用量，采用较老化枝条。,第五节 组织培养常见问题及对策,细胞工程邢朝斌,第四章 植物组织器官培养技术,二、培养物的不良表现及改进措施 （一）、初始培养阶段6.初代培养外植体的褐变 外植体褐变是指在接种后，其表面开始褐变，有时甚至会使整个培养基褐变的现象。,第五节 组织培养常
15、见问题及对策,细胞工程邢朝斌,第四章 植物组织器官培养技术,二、培养物的不良表现及改进措施 （一）、初始培养阶段6.初代培养外植体的褐变 （1）、褐变的主要原因： 植物品种 生理状态 幼龄期的植物材料褐变程度较浅 培养基成分无机盐浓度过高加重褐变 培养条件不当,第五节 组织培养常见问题及对策,细胞工程邢朝斌,第四章 植物组织器官培养技术,二、培养物的不良表现及改进措施 （一）、初始培养阶段6.初代培养外植体的褐变 （2）、减轻褐变现象发生的方法 选择合适的外植体 选择生长处于旺盛的外植体。 合适的培养条件 适当降低培养基温度，及时继代培养。 使用抗氧化剂 连续转移,第五节 组织培养常见问题及对
16、策,细胞工程邢朝斌,第四章 植物组织器官培养技术,二、培养物的不良表现及改进措施 （二）、继代培养阶段 1.苗分化数量少、速度慢、分枝少、苗细高可能原因：细胞分裂素用量不足，温度偏高，光照不足。改进措施：增加细胞分裂素用量，适当降低温度，改善光照，改单芽继代为团块（丛芽）继代。,第五节 组织培养常见问题及对策,细胞工程邢朝斌,第四章 植物组织器官培养技术,二、培养物的不良表现及改进措施 （二）、继代培养阶段 2.苗分化过多，生长慢，有畸形苗，节间极短，苗丛密 集，微型化可能原因：细胞分裂素用量过多，温度不适宜。改进措施：减少或停用细胞分裂素一段时间，调节温度。,第五节 组织培养常见问题及对策,
17、细胞工程邢朝斌,第四章 植物组织器官培养技术,二、培养物的不良表现及改进措施 （二）、继代培养阶段 3.分化率低，畸形，培养时间长时苗再次愈伤组织化可能原因：生长素用量偏高，温度偏高。改进措施：减少生长素用量，适当降温。,第五节 组织培养常见问题及对策,细胞工程邢朝斌,第四章 植物组织器官培养技术,二、培养物的不良表现及改进措施 （二）、继代培养阶段 4.叶粗厚变脆可能原因：生长素用量偏高，或兼有细胞分裂素用量偏高。改进措施：适当减少激素用量，避免叶片接触培养基,第五节 组织培养常见问题及对策,细胞工程邢朝斌,第四章 植物组织器官培养技术,二、培养物的不良表现及改进措施 （二）、继代培养阶段
18、5.再生苗的叶缘、叶面等外偶有不定芽分化出来可能原因：细胞分裂素用量偏高，或表明该种植物适于该种再生方式。改进措施：适当减少细胞分裂素用量，或分阶段地利用这一再生方式,第五节 组织培养常见问题及对策,细胞工程邢朝斌,第四章 植物组织器官培养技术,二、培养物的不良表现及改进措施 （二）、继代培养阶段 6.丛生苗过于细弱，不适于生根或移栽可能原因：细胞分裂素浓度过高，温度过高，光照短，光强不足，久不转移，生长空间窄。改进措施：减少细胞分裂素用量，免用赤霉素，延长光照时间，增强光照，及时转接，降低接种密度。,第五节 组织培养常见问题及对策,细胞工程邢朝斌,第四章 植物组织器官培养技术,二、培养物的不
19、良表现及改进措施 （二）、继代培养阶段 7.幼苗淡绿，部分失绿可能原因：无机盐含量不足，PH值不适宜，铁、锰、镁等缺少或比例失调，光照、温度不适。改进措施：针对营养元素亏缺情况调整培养基，调好PH值，调控温度、光照。,第五节 组织培养常见问题及对策,细胞工程邢朝斌,第四章 植物组织器官培养技术,二、培养物的不良表现及改进措施 （二）、继代培养阶段 8.幼苗生长无力、发黄落叶、有黄叶、死苗夹于丛生苗中可能原因：瓶内气体状况恶化，PH值变化过大，久不转接导致糖已耗尽，营养 元素亏缺失调，温度不适，激素配比不当、缺铁等。改进措施：及时转接、降低接种密度，调整激素配比和营养元素浓度，改善瓶内气体状况，
20、控制温度。,第五节 组织培养常见问题及对策,细胞工程邢朝斌,第四章 植物组织器官培养技术,二、培养物的不良表现及改进措施 （三）、生根阶段 1、培养物久不生根，基部切口没有愈伤组织可能原因：生长素种类、用量不适宜；生根部位氧气不良；生根程序不当；PH值不适，无机盐浓度及配比不当。改进措施：改进培养程序，选用适宜的生长素或增加生长素用量，适当降低无机盐浓度，改用滤纸桥液培养生根等。,第五节 组织培养常见问题及对策,细胞工程邢朝斌,第四章 植物组织器官培养技术,二、培养物的不良表现及改进措施 （三）、生根阶段 2.愈伤组织生长过快、过大，根茎部肿胀或畸形，几条根并联或愈合。可能原因：生长素种类不适，用量过高，或伴有细胞分裂素用量过高，生根诱导培养程序不对。改进措施：调换生长素种类或几种生长素配合使用，降低使用浓度，减少愈伤，改变生根培养程序等。,第五节 组织培养常见问题及对策,细胞工程邢朝斌,第四章 植物组织器官培养技术,
