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类型差示扫描量热法在蛋白质热变性研究中的应用.pdf

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    1、基金项目 :国家自然科学基金项目资助 (30070897)作者简介 :易薇 ,女 ,硕士 3 通讯作者 :胡一桥 ,女 ,教授、博士 ,博士生导师 TelPFax : (025) 83593404 E2mail :hu yiqiao yahoo1com1cn综 述差示扫描量热法在蛋白质热变性研究中的应用易薇 1 ,胡一桥 2 3 (11 中国药科大学 ,江苏 南京 210009 ;21 南京大学生命科学院 ,江苏 南京 210009)摘要 :目的 介绍差示扫描量热法 (DSC)在蛋白质热变性研究中的应用。 方法 以大量具有代表性的文献为依据 ,讨论如何运用 DSC技术研究蛋白质热变性的原因与影

    2、响因素及蛋白质热变性与生理活性的关系。 结果与结论 DSC 在蛋白质热变性研究中的应用有广阔的发展前景。关键词 :差示扫描量热法 ;蛋白质热变性 ;热稳定性中图分类号 :R917 文献标识码 :A 文章编号 :1001 - 2494(2004) 06 - 0401 - 03现代生物技术的发展加速了生理活性肽及蛋白质的大规模生产 ,如何将蛋白质药物安全有效地送达靶部位 ,是药剂研究者关注的焦点。蛋白质的热变性与其空间构象的改变密切相关 ,而空间构象变化可能影响蛋白质的生理活性。差示扫描量热法 (DSC)可提供与蛋白质热变性有关的大量信息 ,如 :蛋白质空间构象的变化、热稳定性、热变性的原因 ,热

    3、变性动力学 ,热稳定性与生理活性的关系等 ,近年来广泛运用于生物大分子的研究。1 DSC在蛋白质热变性研究中运用DSC可根据图谱中的吸放热过程提供有关结构稳定性的信息 ,测定蛋白质构型变化的热效应。相关热转变包括 :熔融、重结晶、分解裂解、释放气体与热容变化、热焓变化等。DSC可分析同一物质不同样品的差异以及辅料对物质热性质的影响。结合药物、聚合物与制剂的热分析图谱 ,可得到药物在聚合物基质中的存在状态 ,如以固体溶液、分子分散或结晶形式存在 ,以及药物与基质可能的相互作用。同时也可分析在制备与贮存过程中各种因素对蛋白质稳定性的影响。在 DSC分析中蛋白质变性过程的基本参数有 :玻璃态转变温度

    4、 Tg ,分子流动的临界温度 Tmc ,蛋白质的变性温度 Td ,热容曲线最大值对应的温度 Tm ,蛋白质变性的热容 Cdp ,蛋白质变性的焓 H ,蛋白质变性的热能量 (效能 ) Qd 。此外 ,DSC曲线上峰面积与峰高的比值可用于表示蛋白质结构中间态的情况。 DSC常与其他分析手段联用 ,如与傅利叶变换红外 FTIR ,圆二色谱法 CD ,X2ray 衍射法联用可以更准确地反应蛋白质的二级结构变化等方面的信息。2 运用 DSC研究蛋白质变性的热动力学热分析技术可以在变温或恒温条件下对物质的反应动力学进行研究 ,将蛋白质变性的历程模型化、公式化 ,用各种理论参数描述蛋白质的热变性反应 1 2

    5、 。211 蛋白质天然态转变成变性态的热动力学蛋白质不可逆热变性的吉布斯自由能与蛋白质从天然态向变性态转变的过程有关 。生理条件下 ,运用微量热法和平衡方法估计热变性或强化学变性 ( Gdmcl) 的 G0D 。运用DSC估计变性的焓变 Hd 与常压热容转变 Cp 。平衡法常数从变性引起的构型转变曲线中测得。运用量热法可测定热变性及 Gdmcl 引起的蛋白质基团 (N 端、 C 端、氨基酸和肽类 )的热容。同一蛋白质热变性的焓值、熵值与化学变性的两值相同 3 。212 蛋白质变性的 3 种转变曲线模型将蛋白质变性的过程用数学方程的形式体现 ,可假设 3个模型 : “直线模型” ,蛋白质变性前后

    6、 DSC 曲线基线的温度依赖性均为线性。“复合直线 P抛物线模型” ,分别用抛物线函数和线性函数描绘蛋白质变性前后 DSC 曲线基线的温度依赖性。“抛物线模型” ,蛋白质变性前后 DSC 曲线基线均为抛物线性温度依赖。用线性模型得到的 HVanm ( Tm 时变性的焓变 ,变性的中点 ) 值最低 ,比量热法所得的 Hcalm (由热分析曲线所得的值 ) 低许多。而用抛物线模型得到的 HVanm 值最高 ,与量热法所得的 Hcalm 很吻合。混合型模型所得的值介于两者之间。但对于同一蛋白质 ,常压下变性的热容改变 Cp 不仅与转变基线的分析模型无关 ,而且与量热法的 Cp 很吻合。 Sinna

    7、等 3 研究溶菌酶等在不同 pH 条件下的可逆热变性。假设转变前后的基线为线性温度依赖性 ,运用吸收光谱法分析蛋白质的形态构型转变曲线 ,估计的 HVanm 比 Hcalm 小许多。如果转变前后的基线为抛物线性温度依赖性 ,则所有蛋白质从平衡方程与热分析曲线得到的 Hm 值很吻合。蛋白质在常压下变性的热容改变值 Cp 不仅与转变基线的分析方法无关 ,而且与量热法测得的 Cp 很吻合。溶菌酶等蛋白质显示两态性质 ,所有的稳定参数与量热法所得的有相同误差。3 运用 DSC研究制剂因素对蛋白质热稳定性的影响311 聚合物基质的降解行为研究蛋白质聚合物给药制剂中聚合物基质的降解行为 ,生成的降解产物均

    8、有可能影响蛋白质药物的活性及释放度。结合 DSC ,NMR ,FTIR等技术可了解聚合物的降解情况 4 5 。104中国药学杂志 2004 年 6 月第 39 卷第 6 期 Chin Pharm J , 2004 June , Vol139 No16 1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http:/Kranz 等 6 研究证明 ,聚乳酸 ( PLA) 的水溶性片段在 Tg以 上时处于高弹态 ,链的运动性强 ,降解快 ,失重大。在加速的大块溶蚀前 ,水化粒子的 Tg

    9、H是粒子降解动力学的重要参数。在大块溶蚀过程后 ,缓冲离子向粒子中渗透率提高 ,并形成盐 ,水溶性降解产物发生了相分离 ,从而降低了粒子的可塑性与自催化效应 ,整体降解速度下降。Gabriele7 运用 DSC研究 PLA ,乳酸羟基乙酸共聚物 (PL2GA)干燥微球与水化微球水解与降解过程中的物理和形态学变化 ,吸收水分的物理状态及离子向球体中的渗透情况。并与降解动力学相比较 ,研究微球的降解情况。干态样品的玻璃态转化温度 TgD 可说明微球基质的形态学转变 ,含水样品的玻璃态转化温度表示为 Tg H。含水量可从 0 左右水的熔融峰对应的焓 Hm 来估计。如水的熔融峰前出现尖峰或熔融峰迁移至

    10、 0 以下说明有离子渗透入微球。此外 ,如果出现了新的吸热峰或者基线发生了迁移 ,说明有结晶或相分离现象。312 蛋白质药物在聚合物中的存在状态用 DSC 在相同扫描条件下分析蛋白质药物、聚合物基质、两者的物理混合物和制剂 ,可得到其相互作用的信息。如果药物的热动力学性质较强 ,熔融吸热峰峰高、峰宽与纯物质相同或相近 ,且未出现位移 ,说明蛋白质与基质没有发生相互作用 ,蛋白质分子保持原有的热动力学性质。结合红外分析的数据 ,如制剂中基团的特征峰与纯物质相比没有发生变化 ,可以证明在复合物中没有物质的相互作用 8 9 。如果熔融吸热峰变宽或发生位移 ,熔化热焓发生变化则说明药物出现了结晶 ,各

    11、组分间发生了物理或化学变化。如果物质的熔融吸热峰几乎消失 ,说明药物以无定形态或不规则结晶态的分子分布 , 或以固体溶液形式存在于聚合物基质中 10 14 。 Zhou 等 15 运用 DSC分析人血清蛋白 ( HSA) 的聚乳酸 2聚乙二醇共聚物 (PELA)微球 ,由 DSC 图谱上 HSA 峰形的变化成功解释了 HAS在制备前后的存在状态。313 制剂中的辅料对蛋白质的影响制剂中所用的辅料可能较大地影响蛋白质的稳定性 。Branchu 等 16 运用 DSC研究了溶菌酶在两种辅料 (蔗糖、羟丙基 环糊精 )存在下的热稳定性可知 ,糖与多羟基化合物通过影响疏水作用的强弱 ,抑制蛋白质从天然

    12、态向变性状态或伸展态的转变 ,常被用作蛋白质的稳定剂。314 蛋白质制剂中的水分情况DSC可用于研究蛋白质制剂的溶胀行为、所吸收水的数量与物理状态、制备过程中的残留水分以及水分对冻干效果及蛋白质热稳定性的影响。热分析曲线可用来测定溶胀速率。假定所有溶胀水分子均有 DSC信号 ,而在干胶和溶胀早期 ,水分子从样品中分解 ,并联到聚合物的亲水部位 ,其流动性很低。这些水分子是非自由态水或称为结合水 ,在 DSC 曲线上无信号。因此 ,可用自由水分子吸热峰的出现速率来估计溶胀速率。 Passerini17 采用干燥法除去 PLA ,PLGA 微球的残留水分 ,DSC分析表明 ,微球在制备后保留一定含

    13、水量 ,干燥条件会影响微球的 Tg 。残留水含量的增加与聚合物 Tg 的下降几乎呈线性关系。4 运用 DSC研究贮存条件对蛋白质热稳定性的影响贮存环境的温度、湿度、 pH值均会影响蛋白质制剂的稳定性。可以通过 DSC分析蛋白质制剂在储存过程中的 Tg ,含水量的变化 ,来分析蛋白质的二、三级结构的完整性 ,研究各种储存因素对制剂稳定性的影响。411 贮存温度的影响从理论上讲 ,玻璃态具有高黏度。蛋白质处于玻璃态时所有构型改变均十分缓慢 ,因此蛋白质在低于 Tg 的温度下贮存时较稳定。当储存温度高于 Tg 时蛋白质的分子运动性增强 ,降解加速。显然 ,蛋白质本身的 Tg 高则相对稳定性好 18

    14、19 。412 贮存湿度的影响当贮存环境的湿度较大时 ,蛋白质制剂会吸收环境中的水分。吸收的水作为增塑剂 ,导致固体系统中分子片段的流动性增加 ,蛋白质的稳定结构易于丧失 16 。蛋白质玻璃态转化温度的下降与制剂中含水量的增加成正比。413 pH值的影响pH对蛋白质热稳定性影响大 ,且随各种蛋白质等电点的差异而不同 ,但总的来讲对各种蛋白质的 Tm ,Toe影响均为正 (即蛋白质的 Tm ,Toe随 pH值升高而变大 ) 。5 运用 DSC研究蛋白质热变性的构象改变与对生理活性的影响在热变性过程中 ,蛋白质的空间构象可能发生变化 ,如链的伸展或折叠 ,基团的重组等 ,相应可能会引起蛋白质生理活

    15、性改变。联用 DSC与其他分析技术 ,可以跟踪考察蛋白质的热变性对其生理活性的影响 ,为制剂研究提供参考。Grinberg等 20 运用高灵敏度 DSC( HS2DSC) 研究 Na + PK+交换 ATP酶的热伸展和域结构。蛋白质的总伸展焓相当低 ,表明 Na + PK+ 交换 ATP酶的热变性并没有导致整个分子的完全伸展。在热变性过程中 ,跨膜片段基本保留原来的二级结构。生理活性配基的联结导致酶的 , 2 个亚单位的构象稳定性明显提高。Remeta 等 21 联用 DSC ,UV ,CD 这 3 种技术 ,用动力学方法研究流行性感冒病毒与红细胞的融合能力 ,证明 X31 流行性感冒病毒在酸

    16、性条件与远低于 HA 伸展转变温度下仍保持其融合能力。Li 等 22 运用荧光、 CD 和 DSC 研究核酮糖二磷酸羟化酶的热变性与失活。证实该酶随着温度的升高 ,空间构象变化加快 ,不可逆程度增加。Roberge 等 23 运用 DSC ,FTIR ,CD研究木聚糖酶 A 单独基质与其接触反应域的伸展 ,研究显示完整酶的热变性较为复杂 ,包括 2 个由酶和接触反应域的热伸展引起的吸热过程和一个由变性接触反应域的聚集和凝结引起的放热过程。聚集和凝结作用可有效排除蛋白质向天然态的重组。Hofbauerova 等 24 结合 CD ,DSC ,UV 研究人血清酸性 糖蛋白在酸性介质中的热稳定性 ,

    17、pH 115 512 范围内的热过程中 ,Trp 残基的行为完全可逆。 Tyr ,Phe 在酸性介质的热过204 Chin Pharm J , 2004 June , Vol139 No16 中国药学杂志 2004 年 6 月第 39 卷第 6 期 1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http:/程中可逆重组。6 结 语蛋白质的空间结构 ,肽链的折叠与其生物学功能的关系 ,是结构生物学领域的核心和前沿问题之一。 DSC 技术与FTIR ,CD ,UV ,NMR等分析

    18、方法相结合 ,研究蛋白质一级序列完整性与空间构象的改变。通过对蛋白质类药物热变性过程的分析 ,获得其空间构象变化方面的大量信息 ,有效运用生物学领域的知识指导剂型的设计与处方研究。但运用DSC研究热变性状态对蛋白质的跨膜行为、肠吸收与转运 ,透过细胞屏障能力的影响机制的研究还较为欠缺 ,需要制剂工作者结合药理、生化知识做进一步努力。运用 DSC 热动力学知识可将蛋白质的变性过程模型化 ,将热动力学模型与生理活性的改变相结合 ,建立蛋白质给药系统的评价理论 ,应是未来研究的热点。参考文献 1 Rishi , Anjum F , Ahmad F , et al. Role of non2compa

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    33、3165645 E2mail :chenhs 10 1631com抗 HCV 药物研究进展邹坚 ,陈鸿珊 3 (中国医学科学院 2中国协和医科大学医药生物技术研究所病毒室 ,北京 100050)摘要 :目的 介绍抗丙型肝炎病毒 (HCV)药物的新研究情况和发展方向 ,为临床和科研提供参考。 方法 参阅国内外最新研究资料文献 ,分析和总结有关领域的新动态。 结果与结论 列述了各种抗 HCV 新药及其作用机制和研究进展。关键词 :丙型肝炎 ;丙型肝炎病毒中图分类号 :R97817 文献标识码 :A 文章编号 :1001 - 2494(2004) 06 - 0403 - 06304中国药学杂志 2004 年 6 月第 39 卷第 6 期 Chin Pharm J , 2004 June , Vol139 No16 1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http:/

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