1、 土壤中邻苯二甲酸酯类的高效液相色谱测定方法研究 编写单位:浙江省地质矿产研究所 项目负责人: 曹攽 编写人: 曹攽 项目组员:刘清辉 马军 李云木子 王雯妮 单位负责人:胡勇平 总工程师:周乐尧 提交单位:浙江省地质矿产研究所 提交时间: 2011年 2 月 1目 录 第一部分 项目概况3 第二部分 高效液相色谱测定土壤中邻苯二甲酸酯类3 导言.3 第一章 实验部分4 1. 仪器与试剂4 2. 实验过程5 第二章 结果与讨论6 1. 空白试验.6 2. 不同萃取溶剂对回收率的影响.7 3. 条件优化.8 4. 方法的线性关系.11 5. 方法的精密度、准确度和检出限.11 6. 标准物质色谱
2、图.12 第三部分 应用.13 第四部分 项目总结14 参考文献.14 2第一部分 项目概况 项目名称:土壤中邻苯二甲酸酯类的高效液相色谱测定方法研究 项目合同书编号: 2009F70062 承担单位: 浙江省地质矿产研究所 项目所属的计划项目类别: 浙江省分析测试科技计划项目 实施单位: 浙江省地质矿产研究所 第二部分 高效液相色谱测定土壤中邻苯二甲酸酯类 导言 邻苯二甲酸酯类(phthalate esters，PAEs，又称酞酸酯)是环境激素类物质中的一类化合物。它们主要用作可用作农药载体、驱虫剂、化妆品、香味品、润滑剂和去污剂的生产原料，其中用量最大为增塑剂，以增大塑料的可塑性和强度，近
3、年来，随着工业生产和塑料制品的使用，邻苯二甲酸酯类不断进入环境，普遍存在于土壤，底泥，生物等环境样品中，其毒性除已知的致畸性、致癌和致突变性外，科研表明其作为环境激素将影响人体内分泌，产生慢性危害1-5。由于邻苯二甲酸酯类的大量使用对生态环境造成了污染，国内外已将此类化合物列为优先控制污染物。其中，邻苯二甲酸酯类物质中有6种被美国EPA列入“优先监测污染物名单” ，它们分别是：邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、二乙酯(DEP)、二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯3(DEHP)、二辛酯(DOP)、丁基苄基酯(BBP) 。我国将邻苯二甲酸酯类中的DMP、DBP和DOP列入优先控制污染物黑名
4、单。 目前国内外已建立了邻苯二甲酸酯类有机物的分析方法，主要有气相色谱法、气相色谱质谱联用法和高效液相色谱法。我国国家环保局行业标准HJ/T72-2001 采用高效液相色谱法测定水中的邻苯二甲酸二甲酯、二丁酯、二辛酯6，样品前处理采用正己烷液-液萃取法，色谱柱为氰基柱，单波长紫外检测。由于土壤样品的基体复杂，所含干扰物质较多，土壤中邻苯二甲酸酯类需经过萃取和净化7,8后才能进行色谱分析，所以在测定前能否有效提取样品中的邻苯二甲酸酯类是至关重要的。 本项目以六种邻苯二甲酸酯为研究对象，采用高效液相色谱法9-14，研究超声波萃取15及索氏提取法对土壤中邻苯二甲酸酯的预分离方法，比较这两种前处理方法
5、对邻苯二甲酸酯的分离效率。以EPA方法和现在方法为基础，结合土壤样品数量较多的实际情况，突出快速批量的检测特点，提高方法重现性及回收率，以快速有效的检测特色来满足地质调查项目及日常工作的要求。 第一章 实验部分 1. 仪器与试剂 高效液相色谱（920-LC）带二极管阵列(PDA)检测器（HPLC，美国varian公司）；LABOROTA 4000旋转蒸发仪（德国海道尔夫公司）；LBM-1J氮吹仪（北京莱伯曼公司）。固相萃取小柱：Cleanert 4ODS-SPE(C18封端，1g/6mL) (Agela Technologies公司，天津)。 六种邻苯二甲酸酯混合标准溶液，浓度均为1000mg
6、/L，购于美国AccuStandard公司；替代物：邻苯二甲酸二苯酯，浓度100mg/L，购于AccuStandard公司；六种邻苯二甲酸酯单标，国家标物中心。正己烷、乙腈、甲醇、丙酮、二氯甲烷均为农残级，购于TEDIA公司。无水硫酸钠和氯化钠，450马弗炉烘4 h，冷却后存放在干燥器中备用。 2. 实验过程 2.1 样品前处理 样品处理: 将采集的土壤样品自然风干、磨碎、过0.25 mm筛，储于干净的棕色瓶中，置于4冰箱中待试。 超声萃取:准确称取10.00 g土壤样品（研磨后），加入5.00 g无水Na2SO4，混合均匀，放置超声提取容器中。加入5 g替代物（邻苯二甲酸二苯酯，DPP），6
7、0 mL正己烷-丙酮混合液（体积比1:1）作溶剂置于超声波发生器中超声提取20 min收集提取液。重复提取三次，合并提取液并浓缩至5 mL，待柱层析净化。 索氏萃取: 称取10.00g土壤样品（研磨后），加入5.00g无水硫酸钠，混合均匀，用净化过的滤纸封好，放置索氏提取容器中。加入5g替代物（邻苯二甲酸二苯酯，DPP），80mL 正己烷-丙酮混合液（体积比1:1）作溶剂置于平底烧瓶中，抽提到设定的时间。收集提取液，旋转蒸发，氮吹至5ml，待柱层析净化。 净化: 用 5ml 含10%丙酮的正已烷溶液和 5 ml 正已烷淋洗净5化柱并弃去该溶液，将样品浓缩液转移到小柱上，用 8mL 正已烷淋洗液
8、分四次洗涤烧瓶，将洗涤液转移到净化柱上，用 10mL 正已烷溶液淋洗小柱，淋洗液收集于平底烧瓶中，浓缩至 2mL 左右，换成甲醇相，用氮气吹至 1mL 定容，供高效液相色谱测定。 2.2 色谱条件 反相分析柱：Pursuit XRs C18 50mm2.0mm2.8m不锈钢柱；流动相为A：水；B：乙腈；梯度洗脱程序见表1；流速：0.2mL/min；柱温：35；紫外波长：225nm；进样量：2L。 表1 梯度洗脱程序 Table 1 Gradient elution procedure Time/min A/% B/% 0 30 703.0 30 70 4.0 0 10010.0 0 100 第
9、二章 结果与讨论 1. 空白试验 由于塑料大量的使用，邻苯二甲酸酯类化合物污染普遍存在，在整个试验中，很容易造成外界邻苯二甲酸酯类的干扰，对溶剂、器皿和试剂等从贮存到使用要严格控制外界邻苯二甲酸酯类的污染。 1.1 试剂空白 取30 mL正已烷-丙酮（体积比1:1）农残级，用高纯氮气吹至1.0 mL后进行液相色谱测定，6种邻苯二甲酸酯类均未有检出。 1.2 全过程空白 6取空白土壤做全过程空白试验，结果见表2。结果表明，6种邻苯二甲酸酯类化合物浓度均低于最低检测浓度，满足分析要求。 表2 空白实验结果（折算到土壤中浓度） Table 2 The results of blank experim
10、ents (transforming the concentration of soils) 化合物 DMP DEP BBP DBP DEHP DOP 浓度/(gg-1) 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 2. 不同萃取溶剂对回收率的影响 文献中报道萃取邻苯二甲酸酯一般选用二氯甲烷、正己烷等溶剂，在EPA3500方法中采用正已烷-丙酮混合溶剂和二氯甲烷-丙酮混合溶剂提取固体样品中的邻苯二甲酸酯，效果较好。本文选择了五种不同的萃取剂，分别为正已烷-丙酮(体积比1:1)、二氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷和甲醇，考察萃取剂种类的不同对回收率的影响，结果见表3。 表3 萃取溶剂对回收率的影响
11、Table 3 Effect of extraction solvent on recoveries of seven analytes 回收率/% 化合物 正已烷-丙酮 二氯甲烷 甲醇 乙酸乙酯 正已烷 DMP DEP BBP DBP DEHP DOP 66.6 85.2 79.3 85.5 99.2 90.2 60.4 35.5 74.1 82.3 98.5 81.9 59.5 71.5 65.2 69.1 76.3 70.7 58.5 73.2 76.3 93.5 93.3 85.2 67.0 76.8 78.8 83.6 83.9 77.8 每组实验平行做3次，且每组均设空白试验。从表
12、中回收率数据看，对于DBP来说，乙酸乙酯作为溶剂的效果好些，而另外五种邻苯二甲酸酯在正已烷-丙酮(体积比1:1)作为溶剂时，回收率较好。土壤基体比较复杂，有较多的干扰物质，并且体系中邻苯二甲酸酯种类7多，溶剂正已烷-丙酮（体积比1:1）比乙酸乙酯更适合于土壤中邻苯二甲酸酯的提取。因此，选择正已烷-丙酮(体积比为1:1)作为实验萃取剂。 3. 条件优化 3.1超声波萃取PAEs的条件优化 以正已烷-丙酮为萃取溶剂，室温下，采用四因素三水平正交设计实验方法，考察了萃取时间、萃取溶剂比例、萃取次数和萃取溶剂用量四个因素对超声波萃取6种邻苯二甲酸酯效率的影响。每个因素均取三个水平，萃取时间分别为5.0
13、 min、10.0 min、20.0 min，萃取溶剂比例分别为正已烷-丙酮（体积比1:1）、正已烷-丙酮（体积比1:3）、正已烷-丙酮（体积比3:1），萃取次数选取1、2、3次，萃取溶剂用量分别是20.0 mL、40.0 mL、60.0 mL。实验结果见表4、表5和表6。 表4 PAEs正交实验方案 Table 4 Orthogonal design of PAEs 序号 萃取时间t/min 萃取溶剂比例 萃取次数 萃取溶剂用量V/ml 1 5 1:1 1 20 2 5 1:3 2 403 5 3:1 3 60 4 10 1:1 2 605 10 1:3 3 20 6 10 3:1 1 40
14、7 20 1:1 3 40 8 20 1:3 1 609 20 3:1 2 20 表5 PAEs正交实验的回收率 Table 5 Recovery of PAEs in Orthogonal test 回收率/% 序号 DMP DEP BBP DBP DEHP DOP 81 41.8 83.3 93.8 94.0 98.1 96.1 2 65.3 78.8 97.0 99.0 101.3 99.1 3 26.6 47.6 86.0 85.3 93.5 90.0 4 72.4 78.1 86.4 91.2 98.3 92.5 5 69.0 79.1 90.6 93.4 97.2 91.2 6 5
15、0.3 75.1 83.7 88.2 90.9 84.2 7 100.7 87.2 102.1 105.1 109.8 100.3 8 95.3 69.3 91.5 96.7 98.7 96.2 9 63.2 83.6 92.3 102.6 103.0 94.4 表6 PAEs回收率的极差分析结果 Table 6 Analytical results of PAEs recovery 项目 DMP DEP BBP DBP DEHP DOP 萃取时间t/min 125.5 30.4 25.2 31.6 25.1 23.0 萃取溶剂比例 89.5 42.3 20.3 14.2 18.8 20.3
16、萃取次数 13.5 26.6 9.7 13.9 14.9 9.5 萃取溶剂用量V/ml 42.3 51.0 18.7 19.1 11.5 3.0 从表5和表6中数据可知，超声波萃取的最佳条件是：萃取时间20 min，萃取溶剂正已烷-丙酮的比例为1:1，萃取次数3次，萃取溶剂用量40 mL。萃取时间对萃取效率的影响最明显，DMP和DEP的回收率随萃取时间增长而增大。萃取溶剂比例影响次之，回收率随丙酮比例增加而增大，但再增大丙酮比例后，回收率下降，因此，选择正己烷-丙酮(体积比1:1)。萃取溶剂用量影响程度较小，减少溶剂对环境的污染，采用萃取溶剂用量为40 mL。 3.2索氏萃取PAEs的条件优化
17、 以正已烷-丙酮为萃取剂，采用三因素三水平正交设计实验方法，考察了萃取温度、萃取溶剂比例和萃取时间三个因素对索氏提取6种邻苯二甲酸酯效率的影响。每个因素均取三个水平，萃取温度分别为40、45、50，萃取溶剂比例分别为正已烷-丙酮(体积比1:1)、正已烷-丙酮(体积比1:3)、正已烷-丙酮(体积比3:1)，萃取时间4h、96h、8h。实验结果见表7、表8和表9。 表7 PAEs正交实验方案 Table 7 Orthogonal design of PAEs 序号 萃取温度/ 萃取溶剂比例 正已烷:丙酮 萃取时间/h 1 40 1:1 4 2 40 3:1 63 40 1:3 8 4 45 1:1
18、 65 45 3:1 8 6 45 1:3 47 50 1:1 8 8 50 3:1 49 50 1:3 6 表8 PAEs正交实验的回收率 Table 8 Recovery of PAEs in Orthogonal test 回收率/% 序号 DMP DEP BBP DBP DEHP DOP 1 113.1 63.5 84.4 86.8 83.9 83.4 2 115.8 83.0 92.7 93.4 100.2 94.2 3 102.9 71.3 83.8 85.3 98.0 85.9 4 112.2 70.5 93.8 82.2 99.1 97.6 5 107.5 76.0 85.9
19、83.6 91.2 87.8 6 104.4 74.4 96.4 88.2 107.5 100.7 7 104.6 86.6 97.4 92.0 103.1 98.3 8 100.1 77.9 84.4 82.5 93.3 87.0 9 61.3 72.4 95.3 88.2 100.5 96.8 表9 PAEs回收率的极差分析结果 Table 9 Analytical results of PAEs recovery 项目 DMP DEP BBP DBP DEHP DOP 萃取温度/ 65.8 19.1 16.2 11.5 15.7 22.6 萃取溶剂比例 61.3 18.8 12.6 2.
20、2 21.3 4.1 萃取时间/h 28.3 18.1 16.6 6.3 15.1 17.5 从表中回收率可知，索氏提取的最佳条件是：萃取温度50，萃取溶剂正已烷-丙酮(体积比1:1)，萃取时间8 h。萃取温度对萃取效10率的影响最明显，回收率随萃取温度增高而增大。萃取溶剂比例影响次之，回收率随丙酮比例增加而增大，但再增大丙酮比例后，回收率下降，因此，选择正己烷-丙酮(体积比1:1)。萃取时间影响最小，DMP和DEP回收率随萃取时间增长而增大，采用萃取时间为8h。 根据上述数据来看，在超声波萃取和索氏提取两种方法优化后条件下，对6种邻苯二甲酸酯的提取的回收率均较佳。但不管从萃取时间上还是萃取温
21、度等方面来看，超声波萃取与索氏提取相比有较大优势，大大缩短了前处理时间，节约能源，提高了批量检测的效率。本项目倾向于采用超声波萃取法对6种邻苯二甲酸酯进行提取。 4. 方法的线性关系 将邻苯二甲酸酯的混合标准溶液和邻苯二甲酸二苯酯的标准溶液均配制成浓度为0.5、1、5、10、50 mg/L做方法标准曲线，线性相关系数r2均大于0.9995；线性方程、相关系数见表10，可见邻苯二甲酸酯的浓度与响应值有很好的线性关系。 表10 邻苯二甲酸酯的线性方程和相关系数 Table 10 The liner regression equations and correlation coefficient o
22、f PAEs 序号 化合物 线性方程 相关系数r21 DMP y=0.41292x+0.31852 0.9995 2 DEP y=-0.04523x+0.32431 0.99993 BBP y=8.44475e-3x+0.22557 0.9999 4 DBP y=0.02827x+0.716736 1.00005 DEHP y=-1.32717e-3x+0.09537 0.9997 6 DOP y=7.99694e-3x+0.09326 0.9999 5. 方法的精密度、准确度和检出限 称取7个10.00 g空白土壤样品，分别加入5 g，邻苯二甲酸酯11混合标准溶液，按选定的前处理条件对邻苯二
23、甲酸酯进行测定，6种邻苯二甲酸酯的平均加标回收率为94.1%108.2 %，按照EPA的方法计算得到相对标准偏差为0.70 %2.42 %。方法检出限（MDL）在0.0030.009 g/g，结果见表11。由表11可知，本方法的准确度和精密度高，且检出限低。样品定量分析采用外标法定量。 表11 方法精密度、加标回收率和检出限 Table 11 Precisions, recoveries and detection limits of the metod 化合物 RSD/% 检出限LD/(gg-1) 回收率/% DMP DEP BBP DBP DEHP DOP 1.09 0.70 1.96 2
24、.09 2.28 2.42 0.008 0.003 0.008 0.008 0.008 0.009 99.2 94.1 106.8 108.2 107.8 98.8 6. 标准物质色谱图 图1 为紫外检测的 6种邻苯二甲酸酯的液相色谱图。可以看出，6 种邻苯二甲酸酯全部出峰时间仅需要 10 min，本方法分析样品的时间短，突出了快速批量的检测特点，且方法重现性及回收率好。 图1 紫外检测6种邻苯二甲酸酯液相色谱图 Fig.1 Chromatogram of PAEs detected by ultraviolet 出峰顺序：1DMP；2DEP；3DPP(替代物)；4BBP；5DBP；6DEHP
25、；7DOP。 12第三部分 应用 应用本实验方法（超声波萃取），对实际土壤样品进行测定。根据替代物（DPP）的回收率来监测提取、净化和分析系统的性能以及本方法的有效性。加入5 g替代物，且回收率控制范围为70%120%。表9数据表明，替代物的回收率均在控制范围内，土壤中含有少量的DMP、DBP和DEHP等邻苯二甲酸酯类物质。 表9 实际土样分析结果 Table 9 Results of PAEs in soil samples m样品/(gg-1) 替代物回收率% 化合物 DMP DEP BBP DBP DEHP DOP DPP A1 0.27 0.03 0.08 0.47 2.27 0.12
26、 96.2 A2 0.67 0.03 0.08 0.25 0.41 0.09 100.6 A3 0.55 0.03 0.08 0.35 1.49 0.09 100.4 A4 0.16 0.03 0.08 0.35 0.91 0.09 104.2 A5 2.27 0.41 1.49 0.91 0.08 0.09 101.5 A6 0.35 0.03 0.08 0.44 0.11 0.09 99.5 A7 0.30 0.03 0.08 0.13 0.08 0.09 97.9 A8 0.53 0.03 0.08 0.08 0.08 0.09 102.0 A9 1.21 0.03 0.08 0.08
27、0.08 0.09 98.3 A10 0.21 0.03 0.08 0.27 1.02 0.09 99.6 A11 0.56 0.03 0.08 0.31 0.08 0.09 97.9 A12 0.35 0.03 0.08 0.47 2.18 0.11 96.2 A13 0.53 0.03 0.08 0.21 0.59 0.09 98.2 A14 0.50 0.03 0.08 0.30 1.55 0.09 103.3 A14 0.22 0.03 0.08 0.08 0.74 0.09 86.2 A15 0.54 0.03 0.08 0.15 2.54 0.09 95.0 A16 0.33 0.
28、03 0.08 0.58 2.15 0.12 96.6 A17 0.67 0.03 0.08 0.23 0.40 0.09 107.0 A18 0.77 0.03 0.08 0.21 1.73 0.09 97.0 A19 0.54 0.03 0.08 0.38 1.72 0.09 99.1 A20 0.18 0.03 0.08 0.29 0.49 0.09 93.0 空白 0.08 0.03 0.08 0.08 0.08 0.09 98.5 加标回收率% 98.8 99.9 100.3 102.7 98.7 99.3 101.2 13第四部分 项目总结 本项目是以超声波萃取和索氏提取两种方法分
29、别对6种邻苯二甲酸酯类化合物进行提取，并对两种方法都进行了条件优化找到了较佳的萃取条件，均得到较高的回收率。两种方法相比较，在获得相当的回收率情况下，超声波萃取要比索氏提取大大缩短了前处理时间，提高了实验的效率，并且超声波萃取温度低，在常温下进行即可，节省能源。本项目倾向于采用超声波萃取法。本实验是采用高效液相色谱分析6种邻苯二甲酸酯类化合物，检测6种邻苯二甲酸酯类仅需10min，与王超英16和林兴桃17等采用高效液相色谱法测定邻苯二甲酸酯类的相关文献报道的时间相比至少缩短6 min；与王硕18，何芃19和王磊20等采用气相色谱-质谱法测定邻苯二甲酸酯类的相关文献报道的时间相比至少缩短10多分
30、钟，同样体现了适用于土壤样品的批量检测。本项目具有方法操作简便、快速，检测时间短，大大提高了效率等特点，同时，具有很好的准确度和精密度，可为科研、生产检测快速准确地提供了分析数据。 参考文献 1 邱东菇, 吴振斌, 贺峰. 内分泌扰乱化学品对动物的影响和作用机制J. 环境科学研究, 2000,13(6): 52-55. 2 出云谕明(日). 威胁人类存亡的定时炸弹-环境荷尔蒙M. 深圳：海天出版社, 1999: 120-122. 143 甘家安, 王西奎. 酞酸酯的生物毒性及其在植物中的吸收积累J. 山东建材学院学报, 1995, 9(4): 23-26. 4 林兴桃, 王小逸, 任仁. 环境
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32、会. 水和废水监测分析方法M. 第四版. 北京：中国环境科学出版社, 2002, 556-565. 10 李波平, 林勤保, 宋欢等. 快速溶剂萃取-高效液相色谱测定塑料中邻苯二甲酸酯类化合物J. 应用化学, 2008, 25(1): 63-66. 11 贾丽, 夏敏, 尹建武等. 高效液相色谱法测定硝基涂料中的增塑剂邻苯二甲酸酯类J. 分析实验室, 2004,23(12): 28-31. 12 张蕴晖, 陈秉衡, 郑力行等. 环境样品中邻苯二甲酸酯类物质的测定与分析J. 环境与健康杂志, 2003, 20(5): 283-286. 13 贾丽, 夏敏, 陈惠. 塑料中邻苯二甲酸酯类化合物的高
33、效液相色谱分析J. 化学通报, 2005, 68(12): 947-949. 1514 马继平, 李茉, 赵秀华等. 固相萃取-反相高效液相色谱法测定水中的邻苯二甲酸酯J. 分析试验室, 2009, 28(3):6-9. 15 贺一训, 刘丽, 杨左军. 气相色谱法测定聚乙烯塑料中增塑剂研究J. 检验检疫科学, 1999, 9(6): 10-12. 16 王超英, 李碧芳, 李攻科. 固相微萃取/高效液相色谱联用分析水样中邻苯二甲酸酯J. 分析测试学报, 2005, 24(5):35-38. 17 林兴桃, 王小逸, 陈明等. 固相萃取高效液相色谱法测定水中邻苯二甲酸酯类环境激素J. 环境科学
34、研究, 2004, 17(5):71-74. 18 王硕, 王琨, 朱华平等. 气相色谱-质谱法检测食用油中有邻苯二甲酸酯J. 食品研究与开发, 2010, 31(9):127-130. 19 何芃. 气相色谱-质谱法同时测定橡塑材料中18种邻苯二甲酸酯类增塑剂J. 塑料工业, 2010, 38(9):60-64. 20 王磊, 张睿, 程爱华等. 固相萃取气质联用测定水中邻苯二甲酸酯类物质J. 中国给水排水, 2007, 23(14):86-89. 16附录： 论文“索氏提取-液相色谱法测定土壤中邻苯二甲酸酯类物质”在地质学刊2011年第一期发表。 论文“超声波萃取-液相色谱法测定土壤中邻苯二甲酸酯”在岩矿测试2011年第二期发表。 17
