1、基因工程的基本操作程序,基因工程的基本操作程序,一、获取目的基因,(一)、目的基因的概念及基因的结构 1、目的基因主要是指_，,编码蛋白质的结构基因,也可以是一些起调控作用的因子,2、原核细胞基因与真核细胞基因的比较,连续,不连续,非编码区,非编码区和编码区中的内含子,编码区,编码区中的外显子,(二)、获取目的基因的常用方法,1、从基因文库中获取目的基因,(1）、基因文库概念：将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库,基因组文库与部分基因文库的比较,大,某种生物的全部基因,某种生物的部分基因,小,有,无,有,无,部分基
2、因可以,可以,（2）基因文库的类型,（3）、从基因文库中筛选目的基因应考虑的因素：序列、功能、位置 转录产物、表过产物等,基因组文库包含着这种生物的所有基因，是用限制酶剪切然后连接上运载体然后导入受体细胞得来的。基因组文库中的所谓基因其实只能够说是DNA片断，这些片断可能正好是一个完整的某基因，也有可能是某基因的一个部分，还有可能包含有几个基因或他们的片断等，在这里，只有那些包含完整基因的片断才能够用于基因交流。 另外还有一种理解是：内含子、启动子、终止子等调控序列在另一种生物体内可能不能正常表达。,基因组文库中的基因只有部分基因能交流的原因,(1）、PCR的原理：DNA双链复制,2、PCR技
3、术（多聚酶链式反应）,(2）、PCR过程,变性（90-95）：高温使H键断裂，形成单链DNA,（3)、特点：,指数式扩增（约2n）,（4)、前提：,模板：引物：原料：酶：,一段已知目的基因的核苷酸序列（以便根据已知序列合成引物）,目的基因,2条（人工合成，2条引物不一定互补）,dCTP、dGTP、dATP、dTTP,耐高温DNA聚合酶（Taq酶）,PCR技术与生物体内DNA复制的比较,高温变性解旋,解旋酶催化,场所,体外,主要在细胞核内,酶,热稳定的DNA聚合酶,解旋酶、DNA聚合酶,温度条件,在较高温度下进行， 不同过程温度不同,常温,原理,DNA双链复制,原料,四种游离的脱氧核苷酸,条件,
4、需模板、能量、酶等,用DNA合成仪合成,3、化学方法人工合成,适用于核苷酸序列已知且碱基数较少的基因,二.基因表达载体的构建基因工程的核心： 1、目的。 使目的基因在_中稳定存在，并且可以遗传给下一代。 使目的基因能够_和发挥作用。 2、组成：_+目的基因+_+标记基因(如抗生素抗性基因),受体细胞,表达,启动子,终止子,3、基因表达载体的构建过程：,限制酶A识别：5- ATGATCAT 3- TACTAGTA ，切割位点是T与G之间；限制酶B识别：5- CAGATCTG3- GTCTAGAC ，切割位点是A与G之间 但是它们产生的粘性末端都是： GATC ,只能用同一种限制酶吗？,例1.(2
5、0分)(2014天津高考)嗜热土壤芽孢杆菌产生的-葡萄糖苷酶(BglB)是一种耐热纤维素酶。 （1）PCR扩增bglB基因时，选用嗜热土壤芽孢杆菌基因组DNA作 。 （2）、下图为质粒限制酶酶切图谱。bglB基因不含图中限制酶识别序列。为使PCR扩增的bglB基因重组进该质粒，扩增的bglB基因两端需分别引入 和 不同限制酶的识别序列。,Nde,BamH,模板,例2.下图是将某细菌的基因A导入大肠杆菌，制备“工程菌”的示意图,据图回答： (1)获得A有两条途径：一是以A的mRNA为模板，在 酶的催化下，合成互补的单链DNA，然后在 的作用下合成双链DNA；二是根据目标蛋白质的 序列，推测出相应
6、的mRNA序列，再按照碱基互补配对原则，推测其DNA的 序列，再通过化学方法合成所需基因。 (2)利用PCR技术扩增DNA时，需添加的有机物质有4种脱氧核糖核苷酸耐热性的 和 、 。 (3)由A和载体B拼接形成的C通常称为 。 (4)在基因工程中，常用Ca2+处理D，其目的是,逆转录,DNA聚合酶,氨基酸,脱氧核苷酸,引物,模板(A基因),基因表达载体,使其成为感受态细胞，有利于吸收重组DNA分子,DNA聚合酶,例3、以下实例为体外处理“蛋白质-DNA复合体”获得DNA片段信息的过程图。,据图回答： (1)过程酶作用的部位是 ，此过程只发生在非结合区DNA，过程酶作用的部位是 。 (2)两过程
7、利用了酶的 特性。 (3)若将得到的DNA片段用于构建重组质粒，需要将过程的测序结果与 酶的识别序列进行比对，以确定选用何种酶。 (4)如果复合体中的蛋白质为RNA聚合酶，则其识别、结合的DNA序列区为基因的 。,磷酸二酯键,肽键,专一性,限制性核酸内切,启动子(或转录起始区),(5)以下研究利用了生物分子间特异性结合性质的有 (多选) A.分离得到核糖体，用蛋白酶酶解后提取rRNA B.用无水乙醇处理菠菜叶片，提取叶绿体基粒膜上的光合色素 C.通过分子杂交手段，用荧光物质标记的目的基因进行染色体基因定位 D.将抑制成熟基因导入番茄，其mRNA与催化成熟酶基因的mRNA互补结合，终止后者翻译，
8、延迟果实成熟,A、C、D,例4.(2014新课标全国卷)植物甲具有极强的耐旱性，其耐旱性与某个基因有关，若从该植物中获得该耐旱基因，并将其转移到耐旱性低的植物乙中，有可能提高后者的耐旱性。回答下列问题： (1)理论上，基因组文库含有生物的 基因；而cDNA文库含有生物的 基因。 (2)若要从植物甲中获得耐旱基因，可首先建立该植物的基因组文库，再从中 出所需的耐旱基因。,全部,部分,筛选,(4)将耐旱基因导入农杆菌，并通过农杆菌转化法将其导入植物乙的体细胞中，经过一系列的过程得到再生植株。要确认该耐旱基因是否在再生植株中正确表达，应检测此再生植株中该基因的 ，如果检测结果呈阳性，再在田间试验中检
9、测植株的 是否得到提高,(4)假如用得到的二倍体转基因耐旱植株自交，子代中耐旱与不耐旱植株的数量比为31时，则可推测该耐旱基因整合到了(填“同源染色体的一条上”或“同源染色体的两条上”)。,(三)将目的基因导入受体细胞,转化:,方法,导入植物细胞,导入动物细胞,导入微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞法,目的基因进入_ 内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,1、将目的基因导入植物细胞的方法：（1）农杆菌转化法(适合双子植物),（2）基因枪法,（3）花粉管通道法,2、将目的基因导入动物细胞-显微注射法,3、将目的基因导入微生物细胞 （1
10、）原核生物特点：单细胞、遗传物质少、繁殖快（2）方法步骤：,用Ca2+处理细胞得到感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子,四.目的基因的检测与鉴定：,目的基因,mRNA,蛋白质,1、利用标志基因进行筛选的原理与方法,为了检测重组质粒是否导入原本无ampR和tetR的大肠杆菌，将大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如图二的菌落。再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图三的结果(空圈表示与图二对照无菌落的位置)。与图三空圈相对应的图二中的菌落表现型是_ _，图三结果显示，多数大肠杆菌导入的是_。,能抗氨苄青霉素，但不能抗四
11、环素,pBR322质粒,2、DNA分子杂交的原理与方法,变性,2.(2015威海模拟)科学家将人的生长激素基因与某种细菌(不含抗生素抗性基因)的DNA分子进行重组，并成功地在该细菌中得以表达(如下图)。请据图分析回答：,(1)过程所示获取目的基因的方法是 。 (2)细菌是理想的受体细胞，这是因为它 。 (3)质粒A与目的基因结合时，首先需要用 酶将质粒切开“缺口”，然后用 酶将质粒与目的基因“缝合”起来。,逆转录法(反转录法),繁殖快、单细胞、遗传物质较少,限制性核酸内切,DNA连接,(4)若将细菌B先接种在含有 的培养基上能生长，说明该细菌中已经导入外源质粒，但不能说明外源质粒是否成功插入目
12、的基因；若将细菌B再重新接种在含有 的培养基上不能生长，则说明细菌B中已经导入了插入目的基因的重组质粒。 (5)检测工程菌中的生长激素基因是否转录出mRNA和是否翻译出生长激素，可采用的技术分别是 、 。,氨苄青霉素,四环素,核酸分子杂交 抗原抗体杂交,4.(2015唐山模拟)基因工程是在现代生物学、化学和工程学基础上建立和发展起来的，并有赖于微生物学理论和技术的发展运用。基因工程基本操作流程如下图，请据图分析回答问题：,(1)图中A是 。 (2)在上述基因工程的操作过程中，可以遵循碱基互补配对原则的 步骤有 (用图解中序号表示)。 (3)不同种生物之间的基因移植成功，从分子水平分析，进行基因
13、 工程的主要理论依据是不同生物的DNA结构的基本形式 (填相同、不相同) ，也说明了生物共用一套 。,载体,相同,遗传密码子,(4)研究中发现，番茄体内的蛋白酶抑制剂对害虫的消化酶有抑制作 用，导致害虫无法消化食物而被杀死，人们成功地将番茄的蛋白酶 抑制剂基因导入玉米体内，玉米获得了与番茄相似的抗虫性状，玉 米这种变异的来源是 。,基因重组,(5)科学家在某种植物中找到了抗枯萎病的基因，并用基因工程的 方法将该基因导入金茶花叶片细胞的染色体DNA上，经培养长成的 植株具备了抗病性，这说明目的基因(抗枯萎病的基因)已 。 如果把该基因导入叶绿体DNA中，将来产生的配子中_ (填“一定”或“不一定
14、”)含有抗病基因。,表达,不一定,【解析】(1)图中A是运载目的基因的载体。 (2)基因工程的操作步骤包括获取目的基因，基因表达载体的构建，将目的基因导入受体细胞，目的基因的检测与鉴定。只有将目的基因导入受体细胞过程不遵循碱基互补配对原则。 (3)基因工程的操作基础是不同生物的DNA结构基本形式相同，且共用一套遗传密码子。 (4)基因工程又称DNA重组技术，其变异原理为基因重组。 (5)如果把抗枯萎病的基因导入叶绿体DNA中，将来产生的雌配子中可能含有抗病基因，雄配子中不含抗病基因。,【考题回访】 1.(2015石家庄模拟)据图表回答问题：,(1)假设所用的限制酶均能将所识别的位点完全切开，采
15、用EcoR和Pst酶切含有目的基因的DNA，能得到 种DNA片段。如果将质粒载体和含目的基因的DNA片段只用EcoR酶切，酶切产物再加入DNA连接酶，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有 、 、,4,质粒质粒连接物,目的基因目的基因连接物,质粒目的基因连接物,(2)为了防止目的基因和质粒表达载体酶切后的末端任意连接，酶切时应该选用的酶是 、 。,EcoR,Sma,（3）若启动子位于图中质粒Sma和EcoR酶切位点之间(左侧)，能否用EcoR和Sma进行切割，进而连接？为什么？,不能。这样会使质粒中的启动子丢失，使形成的基因表达载体无法转录。,不能转录出信使RNA，不能编码蛋白质。有调控序列，如启动子和终止子,：能转录出信使RNA，能编码蛋白质,编码区,非编码区,原核细胞 基因结构,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,启动子,终止子,2、原核细胞的基因结构,注意：启动子起始密码子，终止子终止密码子：启动子和终止子位于DNA片段上，分别控制转录过程的启动和终止；起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译的起始和终止。,3：真核细胞的基因结构,编码区,与RNA聚合酶 结合位点,内含子（不编码蛋白质）,外显子（编码蛋白质）,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,
