1、第二十二章 化学法测定生物化学物质,第三节 骨矿物质与微量元素测定,一、骨矿物质：钙、磷、镁二、微量元素：铁、铜、锌,一、骨矿物质测定,化学比色法：是目前临床实验室常规使用方法。酶法：是血钙、磷、镁测定很有发展前景的方法。其它方法：原子吸收分光光度法（AAS）是参考方法；放射性核素稀释质谱法（IDMS）是决定性方法。,（一）钙测定,1、测定方法概述,临床实验室对钙测定的项目主要有血清总钙测定、离子钙测定和尿钙测定方法： 酶法,其他方法：火焰光度法、离子选择性电极法 AAS法、IDMS法。,化学法,滴定法,比色法,邻甲酚酞络合酮法,甲基麝香草酚蓝法,偶氮胂法,2邻甲酚酞络合酮法测定钙,测定原理,
2、O-CPC是金属络合指示剂和酸碱指示剂，在pH11.0条件下可与钙、镁螯合。加入8羟基喹啉消除镁离子的干扰。O-CPC与Ca2+鳌合生成紫红色螯合物，在575nm处有特征吸收。,方法学评价,优点：O-CPC法是我国卫生部临床检验中心推荐的常规方法，灵敏度0.05mmol/L，线性上限5.00mmol/L。缺点：与Ca2+鳌合的同时亦可与Mg2+鳌合。进行尿钙测定前需先将尿液酸化，以便溶解钙盐。,3偶氮胂法测定钙,测定原理,在弱碱性缓冲液中，钙与偶氮胂显色剂作用生成蓝紫色络合物，650nm波长处有吸收峰。,方法学评价,优点：检测上限为6.25mmol/L，灵敏度为0.01mmol/L；抗干扰能力
3、强；试剂pH受空气中二氧化碳影响较小。缺点：与Ca2+鳌合的同时亦可与Mg2+鳌合。同样可以用于尿钙测定。,（二）磷测定,1测定方法概述,直接分析磷酸盐阴离子（H2PO4-、HPO42-）。方法有：比色法、酶法、其他方法。,2紫外直接比色法测定磷,测定原理,在硫酸存在条件下，无机磷酸盐和钼酸铵反应生成磷钼酸铵化合物，此化合物在紫外线区域（340nm）有吸收峰。,方法性能评价,优点：紫外直接比色法测定血磷是目前临床生化实验室常用的检测方法，测定范围0.16.46mmol/L。缺点：严重溶血因红细胞释放有机磷和磷酸酯酶，影响检测结果。尿液标本可直接检测，超过线性用去离子水稀释后测定。,（三）镁测定
4、,1测定方法概述,比色法：常用的有MTB法、镁试剂比色法、二甲苯胺蓝染料结合法等。酶法：利用异柠檬酸脱氢酶法侧定。其它方法：AAS法、IDMS法。,2二甲苯胺蓝染料结合法测定镁,测定原理,在碱性溶液中， Mg2+和二甲苯胺蓝重氮盐形成紫色复合物，测定520nm波长处二甲苯胺蓝吸光度的降低。,方法学评价,优点：二甲苯胺蓝法是血镁测定的常规方法；线性范围为0.032.0mmo/L；缺点：二甲苯胺蓝也能与Ca2+反应，需加入钙鳌合剂EGTA来掩蔽Ca2+的干扰；尿镁在检测前酸化至约pH1。,二、微量元素测定,AAS法：是血液和尿液微量元素测定的首选方法，特征谱线：铁（248.3 nm）、铜（324.
5、5 nm）、锌（213.8 nm）阳极溶出伏安法：也是测定血清微量元素的较好方法。化学比色法：仍是临床应用的主要方法。,（一）血清铁和总铁结合力及不饱和铁结合力测定,1测定方法概述,AAS法：是参考方法。分光光度法：主要原理相似：即用酸性介质和表面活性剂使与转铁蛋白结合的铁释放出来，再用还原剂将Fe 还原Fe ,Fe 可与显色剂结合显色。未饱和铁结合力：正常情况下血清铁仅能与1/3的TRF结合而运输，与未饱和的TRF全部结合所需的铁量。血清铁和未饱和铁结合力之和为总铁结合力。血清铁与总铁结合力的比值称为铁饱和度。,3+,2+,2+,2亚铁嗪比色法测定血清铁,测定原理,血清中的铁和TRF结合的铁
6、，在酸性介质中铁从复合物中解离出来，被还原剂还原成Fe2+ ，再与亚铁嗪直接作用生成紫红色复合物，波长562 nm处有吸收峰。,方法学评价,优点：亚铁嗪比色法是血清铁测定的常用方法，血清铁在140mol/L以下线性良好。缺点：所用的实验用水及器材要求较高，避免铁污染；Cu2+、Zn2+等有一定干扰，可用巯基乙醇酸、柳醛肟等来掩蔽其干扰；溶血释放出的血红蛋白及颜色对检测结果有明显影响。,3红菲绕啉直接光度法测定未饱和铁结合力,测定原理,540nm波长处有吸收峰,当标本与缓冲液中已知过量的铁混合，标本中的不饱和转铁蛋白会与缓冲液中的铁定量结合，并转化成饱和状态，一部分没有结合的铁，与抗坏血酸和红菲
7、绕啉二磺酸二钠盐作用，生成红色螯合物，在540nm处有吸收峰，通过计算缓冲液中铁的减少可以得出不饱和铁的浓度。,方法学评价,优点： 是目前测定未饱和铁结合力的常规方法，线性可达107.4mol/L；缺点：避免外源性铁污染，标本收集后应立即测定。使用血清或肝素、柠檬酸盐、草酸盐抗凝血浆，不使用DETA抗凝血浆（可产生正干扰）。,（二）血清铜和尿铜测定,1测定方法概述,AAS法：是血清铜测定的首选方法，国外大部分实验室采用AAS法。化学比色法：在一定的解离体系下使Cu2+从其结合蛋白上裂解出来，然后利用不同的显色体系显色测定。包括5-Br-PADAP显色法、双环己酮草酰二腙比色法、二苯基羰酰二肼比
8、色法。,2双环己酮草酰二腙比色法测定铜,测定原理,加稀盐酸使血清中与蛋白质结合的铜游离出来，再用三氯醋酸沉淀蛋白质，滤液中的Cu2+与双环己酮草酰二腙反应，生成稳定的蓝色化合物，在620nm处比色测定。,方法学评价,优点：是全国临床检验操作规程中的推荐方法，线性范围达62.8mol/L。特异性较高，据报告23种阳离子与19种阴离子对双环己酮草酰二腙比色法没有干扰。缺点：灵敏度低，操作步骤繁锁，不宜自动化分析。,（三）血清锌和尿锌测定,1测定方法概述,测定方法有：AAS法、中子活化法、阳极溶出伏安法、酶法、比色法、荧光光度法等。酶法：已取得较大进展，有碳酸酐酶酶法和碱性磷酸酶酶法等。比色法：目前仍是血清锌测定的常用方法。因显色剂不同，主要有5-Br-PADAP比色法、PAN比色法。,25-Br-PADAP测定血清锌,测定原理,血清蛋白沉淀后，Fe 及Cu 被抗坏血酸还原成低价，和其他金属离子一起被氰化物络合而掩蔽。水合氯醛能选择性地释放锌，使锌与5-Br-PADAP反应生成红色复合物，在550nm处比色测定。,3+,2+,方法学评价,优点：是测定血清锌的常用方法，适宜高水平锌的测定，线性达80mol/L。缺点：5-Br-PADAP可与多种离子发生灵敏的显色反应；因红细胞内锌浓度高于血浆，避免溶血，且采血后立即分离，因血小板裂解释放的锌使检测结果偏高。,
