1、微生物学大实验实验题目：土壤微生物的分离纯化与鉴定一 实验目的：1.巩固本学期所学的所有微生物实验操作技能。2.再次强调无菌操作概念。3.初步学习微生物鉴定纯化的方法和思路。4.学会应用相关手册对微生物进行分类。二 实验原理：1. 培养基的制备、消毒与灭菌：培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。在自然界中，微生物种类繁多，营养类型多样，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多。但是，不同种类的培养基中，一般应含有水分、碳源、氮源、能源、无机盐、生长因素等。不同微生物对 pH 要求不一样，霉菌和酵母的培养基的 pH
2、 一般是偏酸性的，而细菌和放线菌的培养基的 pH 一般为中性或微碱性的 ( 嗜碱细菌和嗜酸细菌例外 ) 。所以配制培养基时，都要根据不同微生物的要求将培养基的 pH 调到合适的范围。此外，由于配制培养的各类营养物质和容器等含有各种微生物，因此，已配制好的培养基必须立即灭菌，如果来不及灭菌，应暂存冰箱内，以防止其中的微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养的酸碱度所带来不利的影响。2. 微生物的分离与纯化：自然界中各种微生物混杂生活在一起，要研究某种微生物的特性，首先须使该微生物处于纯培养状态。从混杂的微生物群体中获得只含有某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。土壤是微生物生活的大本营，所含微生物
3、无论是数量还是种类都是及其丰富的。因此，土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，人们可以从中分离到很多有价值的菌株。本实验将采用平板划线分离法。3. 平板分离技术与活菌计数：值得指出的是从微生物群体中经分离、生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征等综合考虑。有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征鉴定方能得到。从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。平板分离法主要有：（1）平板划线分离法， （2 ）稀释涂布平板法。后者除能有效分离纯化微生物外，还可
4、用于测定样品中活菌数量。平板菌落计数法是将待测菌液经适当稀释，涂布在平板上；经过培养后在平板上形成肉眼可见的菌落。统计菌落数，根据稀释倍数和取样量计算出样品中细胞密度。由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，平板上形成的每个菌落不一定是单个细胞生长繁殖而成，有的可能来自 2 个或多个细胞。因此，平板菌落计数的结果往往比样品中实际细胞数低，这就是现在使用菌落形成单位（colony-forming unit，CFU）取代以前用绝对菌落数来表示样品活菌含量的原因。4. 分离菌株的鉴定：微生物的分类鉴定是微生物的重要内容，一般从菌落特征、细菌特点及生理生化、分子生物学等方面进行鉴定。各种细菌在代谢类型
5、上表现了很大的差异。不同的细菌分解大分子碳水化合物、蛋白质和脂肪的能力不同，所能发酵的类型和最终产物也不一样。不同细菌对营养的要求不同也说明了它们有不同的合成能力。所有这些都反映了它们是有不同的酶系统。细菌的这种生化反应的多样性在自然界产生了两种结果：第一、使自然界所有的有机分子都有可能得到分解；第二、使不同细菌之间有了互相作用和互相依赖的基础。另一方面，微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一，细菌的生化反应的多样性也被人们作为细菌的鉴定和分类方法来利用，可以鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。5. 生理生化反应：微生物对大分子物质如淀粉、蛋白质和脂肪等不能直接利用，必须依靠产生
6、的胞外酶将大分子物质分解后，才能被微生物利用。胞外酶主要为水解酶，通过加水裂解大分子物质为较小化合物，使其能被运输至细胞内。如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精、双糖和单糖，脂肪酶水解脂肪为甘油和脂肪酸，蛋白酶水解蛋白质为氨基酸等，这些过程均可通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实。糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应，在肠道细菌的鉴定上尤为重要，绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源，但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异，有些细菌能分解某种糖产生有机酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氢气、甲烷、二氧化碳等） ，有些细菌只产酸不产气。IMViC 是吲哚（ indol） 、甲基红（methyl re
7、d test） 、伏-普（Voges-Prokauer test）和柠檬酸盐（citrate test）四个实验的缩写，主要用于快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌，多用于水细菌学检查。吲哚试验是用于检测吲哚的产生，某些细菌可产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚和丙酮酸。对二甲基氨基苯甲醛遇吲哚形成玫瑰吲哚（红色） 。但并非所有的微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，因此吲哚试验可以作为一个生物化学检测的指标。色氨酸水解反应：吲哚与对二甲基氨基苯甲醛反应：6. 实验整体思路：在确定取样环境之后，对微生物原样进行梯度稀释，产生合适的浓度进行涂板用于微生物的计数。染色并镜检，利用形态学方法对微生物做
8、一粗略的定位。根据镜检设计相关生理生化试验作进一步定位。根据以上获得的信息确定微生物类群并加以定位。三 实验器材：1. 实验菌种：大肠杆菌 金黄色葡萄球菌2. 培养基：牛肉膏蛋白胨培养基，马铃薯培养基，固体油脂培养基，固体淀粉培养基，葡萄糖发酵培养基试管，乳糖培养基试管（内装有倒置的德汉氏小管） ，蛋白胨水培养基，葡萄糖蛋白胨水培养基。3. 溶液和试剂：50%乙醇， 20%的甘油，硝酸银染色液、香柏油、二甲苯、0.01美兰水溶液，卢戈氏碘液，甲基红指示剂，5%孔雀绿水溶液、0.5%番红水溶液，革兰氏染液，草酸铵结晶紫染液，卢戈式（Lugol）碘液，95% 乙醇，番红复染液，香柏油，二甲醇等。4
9、. 土样：山东大学中心校区图书馆前光草坪内地表 10cm 土样。5. 仪器和其他用品：普通光学显微镜，擦镜纸，酒精灯，载玻片，双层瓶，接种环，试管架，镊子，滴管，二甲苯，香柏油，蒸馏水，盖玻片，吸水纸，无菌平板，无菌试管，U 型玻棒，解剖刀，无菌吸管等。四 操作步骤：1.培养基的制备与分装。（1 ）称量：按培养基配方依次准确地称取药品。（2 ）熔化：在沸水浴锅中或电炉上加热熔化。（3 ）调 pH ：用 1mol/L NaOH 或 1mol/L HCl 调 pH 至培养基所需 pH。（4 ）分装：将溶化的固体培养基趁热加至漏斗上，装试管时，注意管口不要沾上培养基。液体分装装量不超过试管的 1/4
10、，固体分装装量不超过试管的 1/5，分装三角瓶的量不超过三角瓶容积的一半，半固体分装装量为试管的 1/3，灭菌后垂直待凝。（5 ）加棉塞：培养基分装完毕后，在试管口或三角瓶口塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能，然后包扎一层牛皮纸。试管先捆成一捆后再于棉塞外包扎牛皮纸，贴上标签，注明培养基名称、日期、组别。2无菌水的制备。（1 ）用量筒量取 90ml 水于带玻璃珠三角瓶中，塞上棉塞，包扎牛皮纸。（2 ）用 10ml 吸管取 9ml 水于 10 支试管中，塞上棉塞，包扎牛皮纸。3器皿的准备。（1 ）培养皿的包装：每 10 套一包，用牛皮纸包扎。（2 ）吸管的包
11、装：首先在吸管的上端塞上一小段棉花，用长纸条包扎、打结。（3 ）玻璃涂布棒的包装：方法同吸管的包装。（4 ）枪尖的包装：放入枪尖盒，牛皮纸包装。4高压灭菌。（1 ）将所要灭菌物品放入高压蒸汽灭菌锅内，根据需要设定灭菌温度和时间（一般 121，20min 灭菌，若培养基中含有葡萄糖等成分时，113 ，30min 灭菌） 。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。（2 ）灭菌完毕，将试管培养基搁成斜面，搁置的斜面长度以不超过试管总长度的一半为宜。培养基冷至 50左右，倒平板。5微生物的分离与纯化。（1 ）土壤稀释液的制备：称取 10g 土壤，放入灭好菌的无菌水中用玻璃珠打碎土壤，静置 30m
12、in。取 10mL 土壤原液于 1 号试管中，从中取 1mL 浸液于装有 9mL无菌水的试管中，充分震荡后依次操作，将 7 支试管按稀释倍数分别记作 0，-1， -2，-3，-4，-5，-6 号试管。0.1ml 0.1ml10-0 10-1 10-2（2 ）涂布平板：分别取 0 度，-2 度和-5 度的试管中的土壤浸出液 0.2ml 于细菌培养基平板上，用刮刀涂布均匀。再分别取 0 度和-3 度稀释液 0.2mL 于准备好的霉菌培养基平板上，涂布均匀。相同稀释度的浸液涂布 3 个平板。10-3（3 ）培养：将细菌培养基平板置于 37恒温箱培养 24h，将霉菌培养基平板置于27 恒温箱培养 3d
13、。（4 ）平板计数及菌落描述：将培养好的细菌进行平板计数（理想为每平板上不多于 30 个菌） ，从而计算出 1g 土壤中细菌数；并观察其菌落形态特征，记录结果。（5 ）平板划线分离：分别选出 5 种细菌、霉菌进行平板划线分离。分别在 37和 28 恒温箱中培养。（6 ）菌种保藏（留作鉴定）：将分离得到的菌种划斜面。每株菌保存 3 支斜面。6.分离菌株的鉴定。（1 ）记录菌种的培养特征。（2 ）细菌的革兰氏染色，记录菌体特征与染色特性。A制片：涂片，干燥，固定。B初染：滴加草酸铵结晶紫染液覆盖涂菌部位，染色 1.5min 后倾去染液，水洗至流出水无色。C媒染：先用卢戈氏碘液冲去残留水迹，再用碘液
14、覆盖 1min，倾去碘液，水洗至流出水无色。D脱色：将玻片上残留水用吸水纸吸去，在白色背景下用滴管流加 95%乙醇脱色2030s，当流出液无色时立即用水洗去乙醇。E复染：将玻片上残留水用吸水纸吸去，用番红复染液染色 2min，水洗，吸去残水晾干。F镜检：干燥后，油镜镜检观察。（3 ）细菌的芽孢染色。A制片：按常规方法涂片、干燥及固定。B加热染色：向载玻片滴加数滴 5%孔雀绿水溶液覆盖涂菌部位，用夹子夹住载玻片在微火上加热染液冒蒸气计时并维持 5min，加热时注意补充染液，切勿让涂片干涸。C脱色：待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗至流出水无色为止。D复染：用 0.5%番红水溶液复染 2min。E水洗
15、：用缓流自来水冲洗至流出水无色为止。F镜检：将载玻片晾干后油镜镜检。（4 ）细菌的鞭毛染色（硝酸银染色法） 。A载玻片制备：将载玻片用洗涤剂清洗干净，置于 95%乙醇中浸泡 5min，使用时用镊子取出在火焰上烧去乙醇及可能残留的油迹。B制片：在载玻片一端滴一滴清水，用接种环从斜面培养物种蘸一两下，再在清水中蘸一两下，然后倾斜玻片，使液体缓慢流向载玻片另一端，用吸水纸洗去多余液体，自然干燥。C染色：滴加硝酸银染液 A 液覆盖菌面 35min 后用蒸馏水充分洗去 A 液。用硝酸银染液 B 液洗去残留水分后，再滴加 B 液覆盖菌面 4050 秒，其间可用微火加热，当菌面出现明显褐色时，立即用蒸馏水冲
16、洗，自然干燥。D镜检：用油镜镜检观察。（5 ）细菌的半固体穿刺试验。A培养基试管的制备：将半固体培养基倒入试管中灭菌后，垂直放置待凝。B接种：将各菌种用接种针分别穿刺接种于半固体培养基中，37恒温箱中培养24h。C观察：观察细菌生长范围并记录，判断细菌是否有运动性。（6 ）查伯杰氏手册，初步对细菌菌种进行鉴定。（7 ）进行以下细菌的生理生化试验：A淀粉水解试验： 将固体淀粉培养基溶化后冷却至 50左右，无菌操作制成平板。 用记号笔在平板底部划成 4 个部分。 将选取的各菌分别在不同的部分点一下，在平板的反面分别在 4 个部分标明所接种细菌。 将平板倒置在 37温箱中培养 24h。 观察各种细菌
17、的生长情况，打开平板盖子，滴入少量卢戈氏碘液于平板中，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板。如菌苔周围出现无色透明圈，说明淀粉已被水解，为阳性。根据透明圈的大小可初步判断该菌水解淀粉能力的强弱，即产生胞外淀粉酶活力的高低。B油脂水解实验 将熔化的固体油脂培养基冷却至 50左右时，充分摇荡，使油脂均匀分布，无菌操作倒入平板，待凝。 用记号笔在平板底部划成 4 部分，分别在 4 部分标明所接种细菌。 用无菌操作将选取的各菌分别划十字线接种于平板的相对应部分的中心。 将平板倒置，37温箱中培养 24h。 取出平板，观察菌苔颜色。如出现红色斑点，说明脂肪水解，为阳性反应。C糖发酵试验 用记号笔在各试管
18、外壁上分别标明发酵培养基的名称和所接种细菌。 取数支葡萄糖发酵培养基试管，分别接入所选菌种，另取一支葡萄糖发酵培养基试管不接种，作为对照。取数支乳糖发酵培养基试管，同样分别接入所选菌种，另取一支乳糖发酵培养基试管不接种，作为对照。在接种后，轻缓摇动试管，使其均匀，防止倒置的小管进入气泡。 将接过种和作为对照的试管均置 37中培养 2448h。 观察各试管颜色变化及德汉氏小管中有无气泡。D吲哚试验 将所选菌种分别接入数支蛋白胨水培养基中，置 37培养 48h。 向培养基内加入 34 滴乙醚，摇动数次，静置 1min，待乙醚上升后，沿试管壁徐徐加入 2 滴吲哚试剂。在乙醚和培养物之间产生红色环状物
19、为阳性反应。E甲基红试验 将所选菌种分别接入数支葡萄糖蛋白胨水培养基中，置 37培养 48h。 将 1 支葡萄糖蛋白胨水培养基培养物内加入甲基红试剂 2 滴，培养基变为红色者为阳性，变为黄色者为阴性。（8 ）霉菌的形态观察。A培养小室的灭菌：在平皿底部铺一张略小于皿底的圆滤纸片，再放一 U 形玻棒，其上放一洁净载玻片和两块盖玻片，盖上皿盖、包扎后于 110灭菌 2030min，烘干备用。B琼脂块制备：通过无菌操作，用解剖刀由马铃薯琼脂薄层平板上切下 1cm2 左右的琼脂块，将其移至培养小室的载玻片上，每片两块。C接种：通过无菌操作，用接种针分别从各霉菌马铃薯琼脂平板培养物中挑取很少量孢子，接种
20、于小室中琼脂块边缘上，将盖玻片覆盖在琼脂块上。D培养：通过无菌操作，在培养小室中圆滤纸片上加 35mL 灭菌的 20%甘油（用于保持湿度） ，盖上皿盖，于 28培养 3 天。E镜检：取出载玻片用低倍镜和高倍镜镜检。（9 ）对照霉菌图谱，对霉菌菌种进行鉴定。五 实验报告：1 细菌的平板计数结果统计：菌液浓度 原浸液10 -4平板 1 2 3 平均菌落数 13 14 13 13.31g 土壤中细菌数约为：6.710 6个。2.细菌的形态特征观察：细菌编号 形状 大小 干湿 颜色 边缘 表面1 圆形 中等 干 白色 不整齐 隆起2 圆形 中等 湿 淡黄 整齐 隆起3 圆形 小 湿 白色透明 整齐 隆
21、起4 不规则 大 湿 乳白透明 不整齐 不隆起5 不规则 大 湿 白色 不整齐 不隆起3.细菌的革兰氏染色及半固体穿刺实验结果：（1） 细菌的革兰氏染色及半固体穿刺实验结果记录：细菌编号 形状 革兰氏染色 芽孢染色 鞭毛染色 半固体穿刺1 长杆状 G+ 有芽孢 有鞭毛 运动2 短杆状 G- 无芽孢 无鞭毛 不运动3 短杆状 G+ 有芽孢 无鞭毛 不运动4 短杆状 G+ 有芽孢 有鞭毛 运动5 短杆状 G+ 有芽孢 有鞭毛 运动（2）图片：细菌的染色实验结果：革兰氏染色1 号菌革兰氏染色（10100） 2 号菌革兰氏染色（10100）3 号菌革兰氏染色（10100） 4 号革兰氏染色（10100
22、）5 号菌革兰氏染色（10100） 标准株 金黄色葡萄球菌革兰氏染色（10100）标准株 大肠杆菌革兰氏染色（10100）芽孢染色1 号菌芽孢染色（10100） 2 号菌芽孢染色（10100）3 号菌芽孢染色（10100） 4 号菌芽孢染色（10100）5 号菌芽孢染色（10100）鞭毛染色1 号菌鞭毛染色（10100） 2 号菌鞭毛染色（10100 无鞭毛）3 号菌鞭毛染色（10100 无鞭毛） 4 号菌鞭毛染色（10100）5 号菌鞭毛染色（10100）4.查伯杰氏手册得知，各菌所属类群如下：菌种编号所属类群（属） 该属主要特征1 芽孢杆菌属菌体杆状，直或接近直，0.3-2.21.2-7.
23、0 微米，多数运动，鞭毛典型侧生。形成抗热内生孢子，在一个孢子囊细胞中，孢子不多于 1 个。暴露与空气中时，不妨碍孢子的形成。革兰氏反应为：阳性、仅在生长早期为阳性、阴性。有机化能营养，利用多种底物进行严格呼吸代谢，严格发酵代谢或呼吸和发酵二者兼有的代谢。在呼吸代谢中，最终的电子受体是分子氧，在一些种种可疑用硝酸盐代替氧，大多数种产接触酶。严格好氧或兼性厌氧。2 不动杆菌属杆菌，通常非常短粗，对数期典型菌为 1.0-1.51.5-2.5微米，静止期近乎球状，排列以成对和短链占优势，在所有的培养物中有少量的大而不规则的细菌和丝状体，但也可占优势，不形成芽孢无鞭毛。有些菌株在固体的表面在特殊情况下
24、显示“抽搐”式的运动。荚膜和纤毛可能有或没有。不产生聚-羟基丁酸盐细胞内含物。革兰氏染色阴性。具氧化代谢的化能异养菌。作为碳和能源而利用的有机物通常是多样化的。无特殊的生长需要，从糖类可能或不能产酸。氧化酶阴性，接触酶阳性。不产生乙酰甲基甲醇、吲哚和H2S。专性好氧菌，最适温度为 30-32，最适 pH 约为 7。抗青霉素。3，4 梭菌属杆状，一般以周生鞭毛运动，很少不运动。形成卵园到球形孢子，一般孢子使杆状菌体膨大，通常为革兰氏阳性，至少在生长的早期如此。有机化能营养。有些种是解糖的，有些是解朊的，有的两者兼备，有的两者皆否，发酵糖，多元醇、氨基酸、有机酸、嘌呤和其他有机化合物。有些种固定
25、N，都不还原 硫酸盐。虽然有些种可在大气压下，在存在空气的情况下生长，但绝大多数菌株是严格厌氧的。一般不产生接触酶，即使产生，数量也少。5 芽孢乳杆菌属细胞直杆状，0.7-0.83-5 微米，单个、成对、很少呈短链，仅为数不多的长周生鞭毛运动。形成内生孢子。革兰氏阳性。有机化能营养，发酵代谢己糖是通过仅仅产生乳酸的典型的同型发酵途径。不含有血红素化合物，如接触酶或细胞色素。微好氧。5.细菌的生理生化试验结果记录：（注：“+”表示在淀粉水解试验、油脂水解试验、甲基红试验、吲哚试验中呈阳性以及在葡萄糖发酵试验、乳糖发酵试验中产酸或产气；“-”表示在淀粉水解试验、油脂水解试验、甲基红试验、吲哚试验中
26、呈阴性以及在葡萄糖发酵试验、乳糖发酵试验中不产酸不产气）细菌编号淀粉水解试验油脂水解试验葡萄糖发酵试验乳糖发酵试验甲基红试验吲哚试验1 - - + - + -2 - - - - - -3 - - + - + -4 - - - - - -5 + - + - + -空白 - - - - - -油脂水解试验葡萄糖发酵试验乳糖发酵试验甲基红试验吲哚试验6.霉菌的形态观察：（1） 霉菌的形态特征：霉菌编号 形态特征1，2菌丝有隔，分生孢子梗亦有隔，顶端不膨大，无顶囊，其分生孢子梗多次分枝，产生对称或不对称的小梗，小顶端有孢子，形如扫帚，称为帚状体。（2） 图片：1 号霉菌（1040） 2 号霉菌（104
27、0）1 号霉菌孢子梗 2 号霉菌孢子梗（3） 对照霉菌图谱，得知：1 号菌和 2 号菌均属于青霉属。六 实验小结通过本次实验，巩固了本学期所学的所有微生物实验操作技能，帮助熟练了无菌操作，并且初步学习微生物鉴定纯化的方法和思路，以及学会应用相关手册对微生物进行分类。最重要的是我们锻炼了团队意识，组员间协作能力大大提高。附：1. 牛肉膏蛋白胨培养基（培养细菌用）牛肉膏3g；蛋白胨 10g；NaCl5g；琼脂 15-20g；水 1000ml；pH7.0-7.2121灭菌 20min。2. 马铃薯培养基（简称 PDA，培养真菌用）马铃薯200g ；蔗糖（或葡萄糖）20g；琼脂15-20g；水1000
28、ml；pH 自然马铃薯去皮，切成块煮沸半小时，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补足水至1000ml。121 灭菌 30min。3. 油脂培养基蛋白胨10g ；牛肉膏5g；NaCl5g；香油或花生油 10g；1.6%中性红水溶液1ml；琼脂15-20g；蒸馏水 1000ml；pH7.2121灭菌 20min。注：不能使用变质油；油和琼脂及水先加热；调好 pH 后，再加入中性红；分装时，需不断搅拌，使油均匀分布于培养基中。4. 淀粉培养基蛋白胨10g ；NaCl 5g；牛肉膏5g；可溶性淀粉 2g；蒸馏水1000ml ；琼脂15-20g121灭菌 20min。5. 糖发酵培养基蛋白胨水培养基1
29、000ml；1.6% 溴甲酚紫乙醇溶液 1-2ml；pH 7.6另配 20%糖溶液（葡萄糖、乳糖、蔗糖等）各 10ml。制法：（1 ） 将上述含指示剂的蛋白胨水培养基（pH7.6）分装于试管中，在每管内放一倒置的小玻璃管（Durhamtube） ，使充满培养液。（2 ） 将已分装好的蛋白胨水和 20%的各种糖溶液分别灭菌，蛋白胨水 121灭菌20min；糖溶液 112灭菌 30min。（3 ） 灭菌后，每管以无菌操作分别加入 20%的无菌糖溶液 0.5ml（按每 10ml 培养基中加入 20%的糖液 0.5ml，则成 1%的浓度） 。配制用的试管必须洗干净，避免结果混乱。6. 蛋白胨水培养基蛋白胨10g ；NaCl 5g；蒸馏水1000ml；pH 7.6121灭菌 20min。7. 葡萄糖蛋白胨水培养基蛋白胨5g；葡萄糖 5g；K 2HPO42g；蒸馏水1000ml将上述各成分溶于 1000ml 水中，调 pH7.0-7.2，过滤。分装试管，每管 10ml，112灭菌 30min。
